小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养20110110

小鼠大脑皮层和海马神经元的分离与培养
一、玻片的准备
A．玻片的清洗
1. 第一天，将玻片(12mm，633009，Carolina) 逐片置于装有浓硝酸(HNO3) 或者洗液的平皿中，混匀，然后浸泡过夜。

2. 第二天，将玻片放在有单蒸水的陶瓷盘中，搁在摇床上晃动，速度为200rpm，将玻片上的硝酸残液清洗干净。

每10min换水一次，要换20次以上。

晚上置于双蒸水中浸泡过夜。

3. 第三天，换双蒸水，重洗两次，每次速度为200rpm ，时间为60min，去除玻片上的离子和其它杂质，最后再换用无水乙醇，清洗三次以上。

洗完后置于小烧杯中，拿到细胞房超净台将玻片浸泡在无水乙醇中室温保存。

4. 解剖小鼠取细胞前两天将玻片从无水乙醇中取出，在酒精灯焰上烘干，稍微在空气中停一下，再放到灭菌的parafilm膜上。

玻片高温易碎，速度要快。

完成后在紫外下照射1h。

B. 玻片的包被（PDL包被）
用0.1M的硼酸钠溶液将PDL配成0.01mg/ml PDL的溶液(pH 8.4)。

1.准备500ml 0.1M的硼酸钠（Na2B4O7·10H2O, B3545-500G，Sigma）溶液。

2.在超净台中，往一整瓶Poly-D-Lysine（PDL，5mg/ml，Sigma, P6407-5MG）中加入25ml的该硼酸钠溶液。

盖上瓶盖，溶解5min，可以轻轻晃动。

然后将该溶液加到剩下的硼酸钠溶液中。

即为所配溶液，0.22μm过滤，用锡纸包好，4℃避光保存。

3.使用的时候，6/12/24孔板每孔加1ml/500μl/250ul的PDL溶液，12mm盖玻片每片加50μl的PDL溶液，放在超净台中，室温包被4hrs或者过夜。

4.第二天，紫外照射超净台1-2hrs，再将PDL吸干。

将板和玻片盖揭开，室温晾过夜。

5.第三天，将每个孔/玻片用灭菌水洗两遍，吸干，盖上盖，避光待用。

二. 大脑皮层与海马的解剖
A. 解剖前的准备
1.解剖器械的灭菌
解剖前将器械放在铝饭盒中，倒入75%乙醇，并在超净台中放入适量卷纸，打开紫外杀菌1-2hrs。

a）解剖显微镜1台
b）手术剪1把
c）眼科弯头镊子2把
d）弹簧剪1把
e）眼科手术剪1把
f）精细45度角镊子1把（进口）
g）精细直镊子1把（进口）
h）精细弯头维纳斯剪1把（进口）
2. 冷冻解剖液的准备
超净台中，取解剖液（Dissection Medium，DM）于3个35mm无菌培养皿（底盖均加）中，放在冰袋上。

Dissection Medium：
HBSS （H2387-10X1L，Sigma）
HEPES 10mM （H6147-100G，Sigma）
Glucose葡萄糖33.3mM （G6152-500G，Sigma）
[CaCl2 2mM (C7902-500G, Sigma) ]可选
Gentamycin庆大霉素5μg/ml （15710-64，Invitrogen）
BSA 0.3% （15260-037，Invitrogen）
MgSO412mM （M2643-500G，Sigma）
0.22μm过滤除菌，存放在4℃.
3.消化液（Digestion Solution，DS）的准备：按以下配方配置好溶液。

Digestion Solution:
NaHCO3 4.2mM （S5761-500G，Sigma）
HEPES 25mM （H6147-100G，Sigma）
NaCl 137mM （S5886-500G，Sigma）
KCl 5mM （P5405-250G，Sigma）
Na2HPO47mM（S5136-100G，Sigma）
以NaOH（S2770-100ML, Sigma）调节pH至7.4。

4.以250ml Digestion Solution溶解Trypsin（T1005-500MG，Sigma）1瓶，使终浓度为2mg/ml，0.22μm过滤除菌，分装后存放在-20℃。

使用前在4℃融化。

5.以Digestion Solution溶解DNase I（D5025-150KU，Sigma）1瓶，使终浓度为1mg/ml，0.22μm过滤除菌，分装后存放在-20℃。

使用前在4℃融化。

6．Neurobasal培养液(Culturing medium)和铺板培养液（Plating Medium），配方如下：Culturing Medium:
Neurobasal-A Medium 500ml (1瓶，10888-022, Invitrogen)
B27 Supplement 10ml （1瓶，17504-044，Invitrogen）
GlutaMax-I2mM （35050-061，Invitrogen）
Gentamycin 庆大霉素1μg/ml （15710-64，Invitrogen）
混匀后4℃存放，尽快使用。

GlutaMax-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。

一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMax-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMax-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

Plating Medium:
Fetal Bovine Serum 10% （SH30406.02，Hyclone）
Culturing Medium 90%
混匀后4℃存放，尽快使用。

解剖前，预热和预冷Plating medium.
7. 实验动物的准备
选取出生后24小时内的P0小鼠，应该尽量选择出生时间短的小鼠，其特点为：身体较小，肤色粉红，肚脐的地方还会有黑色小点。

冬天，取鼠的罐子需预热。

B. 取材
1. 将小鼠放置在冰上麻醉，用75%乙醇给幼鼠全身消毒，并在照射过紫外的卷纸上吸干多余酒精。

2. 用手术剪剪下幼鼠的整个头颅，置于装有冷冻DM的培养皿中（所有培养皿保持放在冰袋上面），稍微洗洗，移至新的冷冻DM中。

3. 用眼科弯头镊子在眼睛位置固定头部，另取一弯头镊子撕去皮肤，暴露头骨。

以弹簧剪沿头骨中线剪开，用弯头摄再撕去头骨暴露大脑。

用镊子将脑整个挑出至新的冷冻DM中。

4. 大脑皮层和海马的解剖过程如下所示。

a）用一镊子固定大脑，另一精细镊子从两脑半球的正中插下去，按图（1）所示的方向推开中脑和间脑组织将两半球分别夹断，将幼鼠的大脑两个半球取出，所得两大脑半球如图（2）所示。

图（1）
图（2）
b）将大脑半球背侧朝上，用一镊子小心夹住大脑的嗅球，固定大脑半球的位置，用另一镊子从嗅球位置开始撕开脑膜，将将脑膜从背侧脱去，再将半球腹侧朝上，将整个脑膜完全脱去。

整个过程如图（3）所示。

图（3）
c）海马去除脑膜后，将海马两端各夹一次，将海马两端和皮层分离，然后延海马和大脑皮层交接处用弯头维纳斯剪剪断，将整个海马从大脑皮层上分离开来。

镊子所夹位置如图（4）所示。

图（4）
d）余下的大脑皮层仅取背侧的部分，用弯头维纳斯剪剪断。

C. 消化
1. 将所有组织收集起来，用眼科剪将其剪成约1mm大小的组织块，以1ml蓝枪头（进口）转移到5ml离心管中，在冰上放置数分钟，待组织完全沉底。

2. 小心吸去上面的DM，加入消化液（含3ml Trypsin和0.8ml DNase I），上下颠倒混匀，放置于37℃培养箱中消化。

消化时间为9min，其中每3min将离心管混匀一下。

3. 消化结束以后，取出离心管，在冰上放置一会儿，待组织沉底。

小心吸去消化液，马上加入预冷的4ml Plating Medium，混匀以终止消化反应，同样在冰上放置待组织沉底，去除终止液。

4. 加入1.5ml预冷的Plating Medium和0.1ml DNase I，用进口1ml’蓝枪头缓慢轻柔吹打20次，冰上放置一会儿。

待未吹打开的组织块沉底后，将悬浮的单细胞转移至新的5ml离心管中。

5. 重复步骤4一次，弃去未吹打开的组织块。

将单细胞悬液以1000rpm离心5min。

6. 离心后，去除上清中的细胞碎片，将细胞沉淀用2ml预冷的Plating Medium重悬。

用计数板进行计数，6/12/24孔板中每孔所需细胞数目为5X105/2X105/1X105个，换算后加入相应数目的细胞，不足的以预热的Plating Medium补齐，6/12/24孔板每孔终体积为2/1/0.5ml。

以前后、左右两个方向混匀培养板或培养皿20次，放入37℃培养箱培养。

7. 细胞计数的方法：计数板中间4X4格子的细胞数为N，则细胞浓度为N X 稀释倍数X 104 cell/ml。

细胞计数时，只数胞体圆，有明显的光圈，且胞体体积大小一致的细胞。

8. 预热Culturing Medium。

D. 换液
种板后4-6hrs，轻轻摇晃培养板，使细胞碎片脱离培养板，去除全部Plating Medium。

以Culturing Medium洗孔1次以尽量去除细胞碎片。

最终每孔加入相应体积的Culturing Medium，重新置于培养箱中培养。

E．抑制胶质细胞的生长
细胞培养到3天以后，胶质细胞基本上覆盖了整个玻片，每孔加50μl FUDR，抑制胶质细胞的进一步分裂生长。

FUDR:
5-Fluoro-2’-Deoxyuridine 5-氟去氧尿苷100mg (1瓶，F0503，Sigma）Uridine 尿苷250mg (U3003，Sigma)
Cuturing Medium 50ml
配制好以后，0.22μm过滤除菌。

－20℃保存。

使用前，用Culturing Medium20倍稀释。

1.将优质玻片清洗干净（方法同细胞培养瓶等玻璃制品）
2.先在培养板中加一滴无细胞的培养基，再放入经过处理的玻片，使其能紧密贴合培养板底部
3.将细胞稀释到合适浓度，配成细胞悬浮液，滴加到玻片上，尽量使其不要散开到培养板底部其它部位，放入细胞培养箱。

4.一个小时后再在孔内加入适当培养基，放入培养箱，继续培养。

(当然以上步骤都要注意无菌操作)
5.待细胞生长达到70-80﹪时，弃去培养液，加入PBS缓冲液五分钟后弃去，重复三次，然后加入适量4﹪多聚甲醛固定30min，弃去，再加入PBS缓冲液，重复上次操作。

6.用镊子轻轻取出玻片（可以使孔内稍微留点PBS，方便操作），滴加中性树胶，将其固定到载玻片上，待胶干后进行后面操作。