紫斑牡丹内生真菌分离培养分子鉴定及抑菌活性研究
滇牡丹内生真菌的分离鉴定及两株抗菌活性菌株代谢产物的研究的开题报告
滇牡丹内生真菌的分离鉴定及两株抗菌活性菌株代谢产物的研究的开题报告一、选题背景滇牡丹（Paeonia ludlowii）是我国特有的多年生药用植物，其具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理活性。
近年来，对滇牡丹的研究逐渐深入，发现其中还潜藏着许多具有生物活性的微生物资源，如内生真菌。
内生真菌是指在植物组织内生长、与植物形成共生关系的真菌，具有生物多样性和生物活性代谢产物，是新药物研发的重要资源。
因此，对滇牡丹内生真菌进行研究，有助于挖掘生物多样性资源，发现新的药物研发方向。
二、研究内容本研究旨在对滇牡丹内生真菌进行分离鉴定，并对其中两株抗菌活性菌株的代谢产物进行研究。
具体研究内容如下：1.对滇牡丹的根、茎、叶及花部位的内生真菌进行分离，筛选出优良的菌株。
2.利用形态学和分子生物学技术对所分离的菌株进行鉴定，并构建菌株的系统发育树。
3.对所分离的菌株进行筛选，筛选出具有抗菌活性的两株菌株。
4.利用色谱技术分离和纯化两株菌株的代谢产物，并对其结构进行解析。
5.对两株菌株的代谢产物进行生物活性评价，探讨其抗菌机制。
三、研究意义1.本研究有助于扩大生物多样性资源，挖掘滇牡丹内生真菌的生物活性代谢产物，为新药物研发提供新的资源。
2.通过对滇牡丹内生真菌的分离鉴定，可以更好地了解其在滇牡丹生长过程中所扮演的生态作用，为滇牡丹的保护提供理论基础。
3.通过对两株菌株的代谢产物进行生物活性评价，可以研究和探究其抗菌机制，为研发新型抗菌药物提供新的思路和途径。
四、研究方法1.内生真菌的分离和筛选。
用无菌锥形瓶培养滇牡丹的根、茎、叶及花等不同部位的样品，用平板法分离内生真菌，筛选出优良菌株。
2.菌株的鉴定和系统发育分析。
利用形态学和分子生物学技术对所分离的菌株进行鉴定，并构建菌株的系统发育树。
3.代谢产物的分离、纯化和结构解析。
利用色谱技术分离和纯化两株菌株的代谢产物，并对其结构进行解析。
4.生物活性评价。
对两株菌株的代谢产物进行抗菌活性测试和细胞毒性评价，探讨其生物活性和抗菌机制。
牡丹内生细菌生物防治技术研究进展
农业科学N O N G Y E KE XU E 牡丹内生细菌生物防治技术研究进展河南科技大学园艺与植物保护学院刘雪停林晓民夏彦飞摘要：近年来植物内生细菌研究越来越受到人们的广泛关注，而关于牡丹内生细菌研究较少。
在综述植物内生细菌的概念、抗病机制基础上，介绍了牡丹内生细菌的生物防治研究进展，分析了存在的问题和展望。
关键词：牡丹；内生细菌；生物防治；研究进展牡丹（Peonia Suffruticosa）是毛茛科、芍药属植物，是多年生的落叶灌木[1]，花期在4月份，果期在5月份。
牡丹花大色艳，品种繁多，素有“国色天香”之称，更有“花中之王”的美誉。
根据牡丹花的颜色可分为红、白、粉、黄、黑、绿、蓝、紫、复色九种，花型有13种，其中以黄色最为尊贵，绿色和黑色为晚期品种，且最为稀有。
唐代诗人刘禹锡的“庭前芍药妖无格，池上芙蕖净少情。
唯有牡丹真国色，花开时节动京城。
”就完美诠释了牡丹的魅力。
在清代末年，牡丹就曾被当作中国的国花。
牡丹不只具有观赏价值，其根皮（丹皮）还具有清热活血、凉血散瘀等功效的药用价值，牡丹花瓣茶、牡丹精油及种子油料等还具有较高的经济价值。
牡丹产业的发展越来越全面和深入。
由于植物内生菌已经成为生物防治工作者研究的热点，它作为生物防治手段优于化学防治，通过内生细菌产生的次生代谢物质、生态位定殖等作用机制来达到防治效果。
而近年来关于牡丹内生菌研究也逐渐进入生物防治工作者的视野，尤其是内生细菌广泛受到生物防治工作者的研究和关注。
一、植物内生细菌的概念内生菌一词是1866年由DeBary首先提出，当时内生菌的概念泛指内生真菌。
在1992年由Kloepper第一次提出了植物内生细菌的概念[2]，丰富了人们对内生菌的认识，为生物防治工作开辟了新的研究方向。
内生菌广泛存在于植物内部，通过植物表面消毒的组织内部分离得到，它们与植物和谐存在。
内生菌不但能够促进植株的生长，还能防治植物病害。
目前植物病害防治主要依赖于化学防治，而化学防治导致的农药残留、环境污染等问题日益严重，因此，生物防治越来越受到人们的关注。
牡丹花提取物抑菌作用的研究
牡丹花提取物抑菌作用的研究
徐春华
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2016(037)015
【摘要】以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌、啤酒酵母、黑曲霉、青霉和黄曲霉作为供试菌株分析了牡丹花提取物的抑菌作用,并探讨了该提取物抑菌效果与pH之间的关系,最后研究了牡丹花提取物的热稳定性.结果表明:牡丹花提取物对细菌、酵母菌和霉菌都有明显的抑制作用,且对细菌(MIC=0.2～0.3)的抑制效果优于酵母菌(MIC=0.4)和霉菌(MIC=0.4).相同pH下的HCl对供试细菌具有一定的抑菌作用,但是效果明显低于牡丹花提取物.此外,牡丹花提取物的具有一定的热稳定性,在55℃以下抑菌活性不会受到影响,但会随着温度和处理时间的增加而降低,在90℃20 min的条件下对供试菌株的抑菌作用全部消失.
【总页数】3页(P163-165)
【作者】徐春华
【作者单位】大连职业技术学院,辽宁大连116037
【正文语种】中文
【相关文献】
1.长裙竹荪乙醇提取物与水提取物抑菌作用研究 [J], 郝景雯;贾士儒;张刚
2.紫斑牡丹花粉不同浓度乙醇提取物抗氧化能力研究 [J], 王斌利;张莉霞;石晓峰;李运;王新娣;邱国玉;沈薇;李志俊
3.牡丹花蕾提取物体外抗氧化、美白活性研究 [J], 余昊阳;熊智;郭一荣;何泉泉;延在昊
4.丁香提取物抑菌作用及稳定性研究 [J], 孙长花;于智勇;丁娟芳;刘妮婷
5.食用菌提取物的抑菌作用研究进展 [J], 倪锦虹;彭亮聪;陈乐;沈惠敏;赵美瑶;陈梅梅
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三种牡丹组织培养比较研究
三种牡丹组织培养比较研究范小峰;郭小强;马世荣【期刊名称】《北方园艺》【年(卷),期】2010(000)004【摘要】以3种牡丹的茎尖为外植体,研究不同品种牡丹茎尖在不同激素配比条件下,愈伤组织和丛生芽的诱导、芽的生长及生根情况.结果表明:适合3种牡丹丛生芽产生的最佳培养基,紫斑牡丹为MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+GA3 0.1 mg/L+Vc 100 mg/L,青心白为MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 100 mg/L,朝霞为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 100 mg/L+Vc 100 mg/L;适合3种牡丹生根的培养基为1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,其中,朝霞生根效果最佳,生根率可达82.35%,紫斑牡丹和青心白分别为75%和50%;活性炭和Vc可有效防止褐化的发生.【总页数】3页(P132-134)【作者】范小峰;郭小强;马世荣【作者单位】陇东学院,生命科学系,甘肃,庆阳,745000;陇东学院,生命科学系,甘肃,庆阳,745000;陇东学院,生命科学系,甘肃,庆阳,745000【正文语种】中文【中图分类】S685.11【相关文献】1.三种七品种牡丹小孢子发生的比较研究 [J], 魏乐;张怀刚2.《牡丹亭·标目》的三种英译本的比较研究 [J], 傅张萌;何大顺3.三种临夏花儿《白牡丹令》歌唱声学比较研究 [J], 丁燕兵;李永宏4.三种牡丹雄蕊发育节律的比较研究 [J], 魏乐;廉永善;张怀刚5.甘肃紫斑牡丹与中原牡丹类群染色体的比较研究 [J], 于玲;何丽霞;李嘉珏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
分子标记技术在牡丹研究中的应用与前景展望
分子标记技术在牡丹研究中的应用与前景展望牡丹是我国传统的观赏花卉之一，具有极高的经济、文化和生态价值。
近年来，随着生物技术的发展，分子标记技术在牡丹研究中得到了广泛应用，并取得了一些重要的研究进展。
一、分子标记技术在牡丹分类和鉴定方面的应用1、随机扩增多态性DNA（RAPD）技术RAPD技术广泛应用于植物基因与遗传多态性的研究中。
通过专门设计的PCR反应条件和随机引物，RAPD技术可以快速鉴定牡丹属、品种之间的遗传多态性，包括相同品种之间和不同品种之间的差异。
RAPD技术不需要专门设计引物和预先知道DNA序列的信息，因此具有快速和廉价的优势。
2、简单序列重复（SSR）技术SSR也称为微卫星，在DNA分子中以重复序列的形式出现，其长度通常为2-6个核苷酸。
SSR技术的克隆和分析速度较慢，但其具有较高的定量精度和鉴别度，因此常常被用于品种鉴定和亲缘关系的分析。
近年来，SSR技术已经被广泛应用于牡丹品种鉴定和遗传多样性研究中，取得了一些重要的研究成果。
ScAR技术是利用单物叶酸基因的简单序列重复区域来进行PCR扩增和鉴定的一种技术。
由于该方法只扩增基因的SNP区域，因此可以减少谱系冗余和扩增比率的影响，从而提高鉴定的准确性。
该技术在牡丹品种鉴定和亲缘关系的分析中具有一定的应用前景。
1、丰富的分子标记资源能够提高研究效率开展分子标记辅助选育的前提是建立牡丹的DNA库，培育牡丹基因序列的数据库。
因此，牡丹的分子标记资源是实现分子辅助育种的关键。
在基因组序列领域，通过建立牡丹基因组数据库，能够准确挖掘新基因和新调控因子，以及对应的分子机制，并且能够完成牡丹基因组的全面注释。
2、分子标记技术可用于牡丹重要特性的基因筛选利用现代分子标记技术，牡丹中某些功能基因已经被发现并鉴定出来。
例如，抗病基因PMC，氨氧化作用相关基因DAMT和SAMT在牡丹中被发现。
利用DNA分子标记技术，可以建立大量样品库，以识别与特定性状相关的基因。
交让木内生真菌的分离和抑菌活性的研究
交让木内生真菌的分离和抑菌活性的研究苏香萍;汪洋;霍丽丽;涂璇【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)003【摘要】[目的]分离交让木中的内生真菌,并研究其抗菌活性.[方法]先采用尖端菌丝挑取法分离纯化交让木的内生真菌,然后依据《微生物分类学》和形态观察初步鉴定其内生真菌,最后用牛津杯法对内生真菌发酵液进行抑菌试验.[结果]从交让木的茎和叶组织部位分离得到8株内生真菌,初步鉴定为半知亚菌门得丝核菌属1种,头孢霉属2种,木霉属1种,青霉属2种,及接合菌纲的毛霉属1种,根霉属1种.其中JR0203菌株代谢产物有较强的抑菌活性.[结论]交让木内生真菌有一定的抑菌活性,值得进一步研究.【总页数】3页(P1041-1043)【作者】苏香萍;汪洋;霍丽丽;涂璇【作者单位】三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002;三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002;三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002;三峡大学化学与生命科学学院,湖北宜昌443002【正文语种】中文【中图分类】S792.24【相关文献】1.甘草内生真菌的分离及抑菌活性研究 [J], 杨林;王磊;胥彤;何俊杰2.紫斑牡丹内生真菌分离培养分子鉴定及抑菌活性研究 [J], 田慧敏;齐小剑;尹元;高原;曾满意;3.乌头中内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性和机制研究 [J], 夏飞; 上官晓雨; 冯思亮; 汪梦雯; 杨苗; 胡松; 郑雪4.中华地鳖虫肠道内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究 [J], 李娜; 李凡; 胡高升; 赵玥; 贾景明5.乌头中内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性和机制研究 [J], 夏飞;上官晓雨;冯思亮;汪梦雯;杨苗;胡松;郑雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
紫斑牡丹与牡丹种间杂交后代的DNA分子证据
紫斑牡丹与牡丹种间杂交后代的DNA分子证据索志立;张会金;张治明;陈富飞;陈富慧【期刊名称】《植物分类与资源学报》【年(卷),期】2005(027)001【摘要】据推测紫斑牡丹Paeonia rockii (S.G.Haw et uener) T.Hong et J.J.Li是直接或间接参与中国牡丹品种群起源的野生种之一,杂交是栽培牡丹品种的重要培育途径.但尚未见到DNA分子方面相关证据的报道.本研究以紫斑牡丹作母本 (♀),分别以3个牡丹品种‘海棠争润'(P.suffruticosa ‘Hai Tang Zheng Rong')、‘胭脂红'(P.suffruticosa ‘Yan Zhi Hong') 和‘盛丹炉'(P.suffruticosa ‘Sheng Dan Lu')作父本(♂),进行人工杂交,获得了杂交后代.利用DNAISSR(Inter-simple sequence repeats,简单重复序列间隔区)标记技术构建的亲子代DNA指纹图谱显示,在杂交后代中检测到了分别来自双亲的特征带,因而在DNA 水平上证实了花瓣基部带紫斑的栽培牡丹品种杂交起源的可能性.【总页数】7页(P42-48)【作者】索志立;张会金;张治明;陈富飞;陈富慧【作者单位】中国科学院植物研究所,北京,100093;中国科学院植物研究所,北京,100093;中国科学院植物研究所,北京,100093;榆中县和平牡丹园,甘肃,兰州,730101;榆中县和平牡丹园,甘肃,兰州,730101【正文语种】中文【中图分类】Q943【相关文献】1.杂交兰种间及杂交后代可溶性糖·可溶性蛋白质及叶绿素含量比较 [J], 朱庆松;张景华;赵海英2.栽培甜菜和白花甜菜种间杂交的研究：Ⅰ.种间杂种后代形态... [J], 郭德栋;王桂芝3.杨山牡丹和牡丹种间杂交后代的DNA分子证据 [J], 索志立;周世良;张会金;张治明4.坛紫菜与长紫菜种间杂交后代的细胞崩溃现象与成活后代的表现型观察比较 [J], 谷灵芝;丁洪昌;严兴洪5.栽培甜菜（Beta vulgaris L．）和白花甜菜（B．corollifloraZoss．）种间杂交的研究Ⅱ．种间杂种回交后代染色体分布及形态变异 [J], 郭德栋;王桂芝;康传红;贾树彪;刘丽萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
牡丹内生真菌多样性
牡丹内生真菌多样性牡丹内生真菌多样性牡丹（学名：Paeonia lactiflora）是中国的传统名贵花卉之一，以其优美的花朵和独特的药用价值而闻名于世。
牡丹的欣赏价值和药用功能与其内生真菌多样性关系密切。
内生真菌是指与植物共生并在其组织内生活的一类微生物。
牡丹内生真菌多样性研究对于了解牡丹的生态特性、发展新品种、保护和利用资源具有重要的科学意义。
早在20世纪60年代，中国学者就开始对牡丹内生真菌进行初步的研究，但是由于技术限制，当时的研究主要局限于传统的菌根、菌核和菌丝状真菌的观察。
近年来，随着分子生物学和生物信息学等技术的发展，牡丹内生真菌多样性的研究得到了很大的进展。
通过采集不同产地的牡丹根际土壤和植体样品，科研人员利用高通量测序等方法对内生真菌进行了深入的分析和鉴定。
研究结果显示，牡丹内生真菌多样性丰富，包括接近40个属、100多个种，其中以Trichoderma、Fusarium、Phoma 和Alternaria等为主要属。
这些内生真菌与牡丹的生长、养分吸收和抗病能力密切相关。
例如，Trichoderma属真菌能够分解土壤有机质，促进植物根系的发育和养分吸收。
而Fusarium属真菌则可能引起牡丹的病害，导致植株凋萎和死亡。
此外，研究还发现，不同产地、不同根际土壤类型的牡丹内生真菌组成存在差异。
这表明，地理环境和土壤特性对牡丹内生真菌多样性的形成和变化有着重要的影响。
例如，酸性土壤中的牡丹更容易寄生一些特定的真菌种类，而碱性土壤中则寄生的真菌种类不同。
牡丹内生真菌多样性的研究还发现了一些新的潜在生物资源。
有一些内生真菌具有生物活性物质的生产能力，例如产生抗菌物质、抗氧化物质等。
这些生物活性物质对人类的健康和疾病治疗具有潜在的应用价值。
因此，对于这些具有生物活性物质生产能力的内生真菌的研究和开发具有重要的意义。
总之，牡丹内生真菌多样性的研究不仅有助于深入了解牡丹植物本身的生物学特性和生态习性，还为牡丹的栽培和种质资源保护提供了科学依据。
对牡丹真菌病害拮抗抑菌效果的研究
河南科技大学本科生毕业论文枯草芽孢杆菌对牡丹真菌病害拮抗抑菌效果的研究摘要生物防治技术是通过选育对人类健康安全可抑制或杀灭植物病原菌的特殊微生物，经培养施加于作物栽培环节，达到代替化学农药防治作物病害的目的。
生物防治技术的原理主要是利用各种有益的微生物，通过生物间的竞争作用、拮抗作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发植物抗病性等，来抑制某些病虫害的繁殖和活动，以达到生物防治的目的。
本研究对危害洛阳市重要品牌花卉——牡丹的主要病原真菌的拮抗菌进行筛选并加以鉴定。
从96株芽孢杆菌中，以牡丹褐斑病病原菌作为靶标，采用抑菌圈法，以抑菌效果即抑菌圈大小为标准，进行拮抗芽孢杆菌的筛选。
得到两株抑菌效果最为显著的芽孢杆菌菌株，抑菌圈直径分别为5.68mm和5.97mm。
继而通过一系列鉴定试验，包括菌落和菌体特征观察以及生理生化特征试验，对上述试验结果进行综合评价，最终确定拮抗菌株LM-18和LM-83均属于枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)。
关键词：牡丹，枯草芽孢杆菌，拮抗，筛选，鉴定枯草芽孢杆菌对牡丹真菌病害拮抗抑菌效果的研究An Study on The Antagonistic Effect of Bacillus SubtilisAgainst Peony Fungal DiseasesABSTRACTBiological Control technology through breeding specific microbes that is health and safety to human and can suppress or kill plant pathogens.By the training session and imposed in crop cultivation,it can reach the purpose that replacing chemical pesticides to control crop diseases.The main principle of the Biological Control Technology is to use a variety of beneficial organisms,through the effect of competition,antagonism,re-parasitic,cross-protective,and induced plant disease resistance between biological roles to inhibit the reproduction and activities of some pests and to to achieve biological control purposes.In this study,we oppose a major pathogenic fungi bacteria that endanger Peony that the important brand flowers in Luoyang City to screene and identify.With inhibition zone method and to Peony leaf spot as a target,according the zone size of inhibition as the standard to screen from the 96 Bacillus.There are two Bacillus strains that the inhibitory effect is most significant,and the diameters of the inhibition zone are 5.68mm and 5.97mm.Then through a series of identification tests,including colony and cell characteristics observed and physiological and biochemical characteristics test,to evaluate the results on the comprehensive.The antagonistic strain LM-18 and LM-83 belong to the genus Bacillus (Bacillus subtilis) to finalize.KEY WORDS：Peony，Bacillus subtilis，Antagonistic，Screening，Identification河南科技大学本科生毕业论文目录摘要 (I)ABSTRACT (II)目录............................................................................................................................ I II 第一章文献综述.. (1)1.1 拮抗微生物研究现状 (2)1.1.1 生物防治 (2)1.1.2 微生物防治 (2)1.1.3 拮抗微生物 (2)1.1.4 非拮抗微生物 (2)1.2 芽孢杆菌生物制剂的研究进展 (3)1.3 牡丹产业化发展及主要病害 (5)1.3.1 洛阳牡丹产业化状况 (5)1.3.2 牡丹病害 (6)1.4 本研究的目的和意义 (7)第二章试验部分 (8)2.1 材料 (8)2.1.1 样品的采集 (8)2.1.2 供试植物病原菌 (8)2.1.3 待鉴定的芽孢杆菌 (8)2.1.4 培养基 (8)2.1.5 试剂与染液 (9)2.1.6 主要仪器 (9)2.2 方法 (9)2.2.1 样品中芽孢杆菌的分离纯化 (9)2.2.2 牡丹褐斑病拮抗菌的筛选 (9)2.2.3 细菌鉴定 (10)2.3 结果与分析 (12)2.3.1 样品中芽孢杆菌的分离纯化 (12)2.3.2 牡丹褐斑病病原菌拮抗菌的筛选 (12)2.3.3 拮抗菌株的鉴定 (13)2.4 结论 (15)2.5 讨论 (16)参考文献 (17)致谢 (19)英文翻译 (20)河南科技大学本科生毕业论文第一章文献综述我国地域辽阔，气候条件复杂，种植的农作物及其病害种类繁多，主要病虫害有1500多种，特别严重的有几十种，它们频繁发生成灾，造成大量农业经济损失，是阻碍我国农业经济发展的突出问题之一。
紫斑牡丹的化学成分、活性与开发利用研究进展
紫斑牡丹的化学成分、活性与开发利用研究进展
彭腾腾;范彬;石晓峰;王信
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】2024(36)4
【摘要】紫斑牡丹是我国西北牡丹种群的优势种,其作为地方传统药材,具有较高的食药价值和开发潜力。
目前,已经从紫斑牡丹中分离和鉴定出了多种化学成分,包括单萜苷类、酚及酚苷类、黄酮类、低聚芪类、挥发油类、脂肪酸类、甾醇类、单宁类、三萜类等。
现代研究表明,紫斑牡丹具有抗氧化、抗菌、抗癌等活性,已将其开发为口含片、软胶囊、口服液、保健化妆品、牡丹酒、花茶等新资源产品。
本文主要对近10年国内外有关紫斑牡丹的化学成分进行分类整理,对其活性及开发利用现状进行梳理,并对发展前景进行展望,以期为紫斑牡丹的深入研究和综合开发利用提供参考。
【总页数】19页(P717-735)
【作者】彭腾腾;范彬;石晓峰;王信
【作者单位】甘肃中医药大学药学院;甘肃省医学科学研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R932
【相关文献】
1.定西市油用紫斑牡丹资源开发利用对策研究
2.紫斑牡丹花粉乙酸乙酯部位化学成分研究
3.牡丹籽活性成分及综合开发利用研究进展
4.油用牡丹不同部位化学成分与开发利用研究进展
5.紫斑牡丹花粉化学成分及其体外抗氧化活性
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紫斑牡丹种子生活力测定
紫斑牡丹种子生活力测定李成忠;史锋厚;刘行;孙燕;成孜文【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2017(36)6【摘要】以紫斑牡丹(Paeonia rockii)种子为研究对象,通过浸种、剥除种皮、纵切、横切、剥出种胚等预处理,进行四唑溶液染色,探究四唑染色法测定牡丹种子生活力的最佳方案.结果表明:用始温50℃水浸种24 h,剥除种皮,放入15℃恒温培养箱培养24h,然后剥出种胚用0.5％的TTC染液染色6h为最佳方案.%Taking the purple peony seed as the research materials,to explore the best solution of the determination of the seed viability,with TTC method by comparisonand analysis.This study first designed 14 set of preliminary experiments by a lot of processing like seed soaking,removal of seed skin,longitudinal cutting of embryo,crosscutting of embryo,stripping out embryo,then sorting the analysis of the test results,show that the best solution is first immersed seeds with water in the beginning temperature of 50 ℃ water with 24 h,removing seed skin and putting seeds into constant temperature incubator of 15 ℃ for 24 h,then peeling out of embryo and put them into TTC of 0.5％ concentration dyeing 6 h.And then,on the basis of the scheme,to deepen the experiment,the study try to find the best dyeing process when the TTC solution concentration was 0.1％,0.5％ and 0.5％when dyeing 1 h or 3 h or 6 h or 9 h or 15 h.The test results show thatwhen the concentration of TTC is 0.5％,dyeing time is 6 h and at the request of the cost savings can obtain best dyeing effects.【总页数】3页(P20-21,25)【作者】李成忠;史锋厚;刘行;孙燕;成孜文【作者单位】江苏农牧科技职业学院园林园艺系,江苏泰州225300;南京林业大学林学院,南京210037;江苏农牧科技职业学院园林园艺系,江苏泰州225300;江苏农牧科技职业学院园林园艺系,江苏泰州225300;南京林业大学林学院,南京210037【正文语种】中文【中图分类】S685.11【相关文献】1.滇牡丹和紫斑牡丹胚乳中氮磷含量的测定 [J], 李保印;周秀梅;程灵芝2.紫斑牡丹丹皮的成分测定 [J], 曹小勇;周建军;毛治彦;姜峰3.TTC法测定金荞麦种子生活力条件的优化 [J], 檀龙颜;吴依琳;马洪娜4.狭域珍稀濒危植物茶果樟种子生活力测定研究 [J], 李孙玲;景跃波;李淑芳;康洪梅;陈勤5.电感耦合等离子体原子发射光谱法测定紫斑牡丹胚乳和胚中矿物质元素 [J], 周秀梅;李保印因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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World Journal of Forestry 林业世界, 2018, 7(3), 83-89Published Online July 2018 in Hans. /journal/wjfhttps:///10.12677/wjf.2018.73011Study on Identification and AntimicrobialActivity of Endophytic Fungi Separationfrom Paeonia rockiiHuimin Tian, Xiaojian Qi, Yuan Yin, Yuan Gao, Manyi ZengLife Science of Chifeng University, Chifeng Inner MongoliaReceived: Jun. 29th, 2018; accepted: Jul. 13th, 2018; published: Jul. 20th, 2018AbstractIn this study, the endophytic fungi of root, stem, leaves from Paeonia rockii were isolated and cul-tured. According to the morphological and cultural characteristics and other biological characte-ristics, the isolates were identified by rDNA-ITS sequence analysis. The antibacterial test was per-formed on the isolates and Fusarium oxysporum by the plate-to-lime method to screen endophyticfungi with antibacterial activity. The results showed that 20 endophytic fungi were obtained from Paeonia rockii and 11 species were identified by rDNA-ITS sequence analysis. J2 was Paraphoma chrysanthemicola(Hollós) Gruyter (epigamous),Boeremia sp. (phorozoon); J6H was Aspergillus calidoustus Varga, and J7HEI was Colletotrichum coccodes (Wallr. S. Hughes); J8 is Gibberella intri-cans Wollenw (epigamous), Fusarium sp. (phorozoon); G9 is Phoma multirostrata (PN Mathur, SK Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema (phorozoon) Boeremia sp. (epigamous); G1 and G6 are Py-renochaeta lycopersici RW Schneid. & Gerlach, J1 is Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm, G5 is Gibberella sp. (epigamous), and J6HUI2 is Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai; J7HUI is Peyronellaea sp. J1 and J6HUI are new to China, of which G5, G9, J1 and J2 can inhibit Fusarium oxysporum in different degrees, the average inhibition rates being 57%, 57.2%, 28.8% and 54.8%, respectively.KeywordsPaeonia rockii, Endophytic Fungi, Molecular Identification, Antimicrobial Activity紫斑牡丹内生真菌分离培养分子鉴定及抑菌活性研究田慧敏，齐小剑，尹元，高原，曾满意赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰田慧敏等收稿日期：2018年6月29日；录用日期：2018年7月13日；发布日期：2018年7月20日摘要本研究对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养，根据形态学特征、培养特性及rDNA-ITS序列分析相结合的方法对分离到的菌种进行鉴定，并对其与黄瓜枯萎病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum 同时接种进行抑菌试验，以筛选抑制尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的内生菌菌株。
结果表明，从紫斑牡丹中获得20株内生真菌，经形态和分子共鉴定出11种，J2为菊拟茎点霉菌Paraphoma chrysanthe-micola (Hollós) Gruyter，J6HUI为Aspergillus calidoustus Varga，J7HEI为马铃薯刺盘孢Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes，J8为木贼镰刀菌Fusarium equiseti (Corda) Sacc；G9无性型为多喙茎点霉Phoma multirostrata (P.N. Mathur, S.K. Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema，有性型为Boeremia sp.；G1、G6为番茄棘壳孢Pyrenochaeta lycopersici R.W. Schneid. & Gerlach，J1为Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm，G5为Fusarium sp.，J6HUI2为Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai；J7HUI为Peyronellaea sp. (派伦霉属)，J1和J6HUI为中国新记录种，其中4株具有抑菌作用，G5、G9、J1和J2对黄瓜枯萎病具有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分别为57%、57.2%、28.8%和54.8%。
关键词紫斑牡丹，内生菌，分子鉴定，抑菌实验Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/1. 引言植物内生真菌是指在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌[1]，主要为子囊菌及其无性型，少数担子菌和接合菌。
内生真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间，从寄主中吸收营养物质，如光合产物和矿物质供其生长所需，同时内生真菌为寄主生长发育提供水分、矿质元素等，二者互利互惠[2]。
植物内生真菌普遍存在于植物组织中，其代谢物不仅能刺激植物生长发育、增强寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力[3]，而且能提高植物对病虫害的抵抗力[4]-[9]，研究发现植物内生真菌能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗菌素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等，极有可能成为发现和生产生物活性物质的重要来源，在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景。
紫斑牡丹(Paeonia rocki)是芍药科芍药属植物，因其花大色艳，植株高大，香味浓郁，在世界上享有崇高声誉，是中国特有植物，极富观赏价值。
许多研究者对牡丹内生真菌做了研究，发现从牡丹分离到的多种内生真菌具有抑菌活性[10][11][12][13][14]，然而国内关于紫斑牡丹内生真菌的报道极少，且尚未见抗逆性菌株筛选相关研究，本研究采用组织分离法对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养并做抑菌实验，以期寻找具有抑菌作用的菌株。
田慧敏等2. 材料和方法2.1. 供试材料来源供试标本实验材料为采集于农场、学校等地的牡丹植株，新鲜健康植株的各部分组织，如根、茎、叶，当天进行处理分离培养。
2.2. 内生真菌的分离和纯化选取健康的牡丹植株，截取根、茎、叶3个部位，用自来水冲洗干净，晾干表面的水分，0.1%升汞漂洗1 min，然后用冰醋酸冲洗，再用75%酒精，漂洗0.5~1 min，无菌水反复清洗。
样品经过处理后，在无菌状态下切成0.2 cm × 0.2 cm片，置于PDA培养基上培养，每个皿放置4个样品。
在28℃的条件下培养3~7 d，观察记录皿中材料，取切口处培育出的菌落，挑取切口处，挑菌落边缘的菌丝转接到新的PDA培养基，进行2~3次的纯化筛选到内生真菌，每次将最后一次冲洗完的无菌水涂布在PDA培养基上作为对照组。
2.3. 内生真菌的分子鉴定2.3.1. 内生真菌基因组提取及PCR扩增及测序鉴定基因组DNA快速提取法提取培养菌种基因组DNA，用天根PFU PCR mix进行PCR扩增，用引物ITS1F/ITS4R (TCCgTAggTgAACCTgCgg/TCCTCCgCTTATTgATATgC)对G1、J2、J6HUI、J6HUI 2、J7、J7HUI、J8扩增ITS区域；用引物27F/1492R (L) (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGA CTT)对J1、G5、G6和G9扩增16S rDNA区，对所得PCR产物进行切胶纯化回收(DNA凝胶纯化试剂盒，AXYGEN)，使用NL4对回收DNA片段进行DNA测序(3730 xl, ABI)。
2.3.2. DNA序列比对分析将得到的DNA序列在GenBank数据库和UNITE进行Blast检索比对，从结果中挑选出同源性较高的DNA序列，查找相似性最高的菌种，确定分离菌株的分类地位。
利用软件MEGA6.01按照最大似然法构建系统进化树，发育树的每个分支的统计学显著性分析重复次数为1000次。
2.4. 对黄瓜枯萎病菌的抑制实验尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum, FO)在无菌操作台上将黄瓜枯萎菌接种于PDA培养基(d = 10 cm)中心，周围接种相应的内生菌四个接种点，置于20℃~25℃，培养48 h后测量抑菌圈直径，抑菌率= D CK−D X/D CK × 100，D CK = CK菌落直径，D X = 对峙培养后尖孢镰刀菌的菌落直径。