实验课4——【医学微生物学精品讲义】

生化反应——吲哚试验（indole test）
原理：有些细菌具有色氨酸 酶，能够分解色氨酸生成吲 哚，吲哚 再与对二甲基氨基 苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚， 呈现红色。
方法：将待检菌接种至蛋白 胨水培养基中，37℃培养1-2 天，沿管壁徐徐加入柯凡克 0.5ml，即刻观察结果。
结果观察：液面交界处呈红 色着为阳性，无红色者为阴 性。
每支试管中分别加入生理盐水0.5ml。 吸取1:10稀释血清2.5ml分别加入各排第1管中，每管0.5ml。 于第1排第1管内用1ml吸管吸吹三次充分混匀，再吸出0.5ml 到第2管作等倍稀释，并依次类推直至第5管为止。再从第5管 吸出0.5ml弃去。后4排稀释方法相同。每排各管的血清稀释 度分别为1:20，1:40，1:80，1:160，1：320。每排第6管不加 血清，作为对照。
生化反应-单糖发酵(sugar fermentation)
• 如：葡萄糖及乳糖发酵 实验目的
了解糖发酵试验方法 实验材料
菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌培养物 培养基：乳糖及葡萄糖发酵管 实验方法 用接种环将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种于葡 萄糖及 乳糖发酵管中。 37℃孵育18~24小时，取出观察结果。溴甲酚紫 [pH5.2（黄色）～6.8（紫色）]，当发酵产酸时， 可使培养基由紫色变为黄色。
2ml
0.5%美兰水溶液（灭菌
1ml
功能：金黄色葡萄球菌不生长；大肠埃希菌菌落呈紫
红色，有时呈现金属光泽；伤寒沙门菌菌落呈灰白色
或无色。
大肠杆菌（EMB培养基）
肠道致病菌（EMB培养基）
SS琼脂培养基
成份：肉膏汤琼脂
100ml
乳糖
1g
胆盐
0.85g
枸椽酸钠
0.85g
硫代硫酸钠
0.85g
10%枸椽酸铁水溶液 1ml
玻片凝集试验操作程序与结果
方法：取一洁净载玻片，用接种环取待检菌培养 物，分别与诊断血清和生理盐水混匀，轻轻晃动 玻片数次。1-3分钟后观察结果。
结果观察：阳性—待检菌明显凝集，对照菌均匀 浑浊；阴性—待检菌与对照菌均浑浊。
试管凝集-Widal test
(一)实验目的与原理 用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙、丙型副伤寒
2g 0.5g 0.1g 1g 0.05g 0.075g 1.5g 1.25ml 100ml
肠道杆菌在KI培养基上的培养特性
说明：C 对照组；1 肠道非致病菌；2 志贺菌；3 沙门菌；4 /4A 大肠杆菌；5 变形杆菌。 该培养基有助于肠道可疑细菌的初步鉴定，酚红为指示剂。当细菌 分解乳糖大量产酸，会使培养基变黄色。如果只分解葡萄糖，产酸 量少，只是试管底部变黄。如果产生硫化氢，与铁反应，生成黑色 沉淀，培养基变为黑色。如果产酸产气，在试管底部产生气泡，可 将培养基顶起。
加入抗原 第1排各管加伤寒杆菌O抗原0.5ml； 第2排各管加伤寒杆菌H抗原0.5ml； 第3排各管加甲型副伤寒杆菌（A）抗原0.5ml； 第4排各管加乙型副伤寒杆菌（B）抗原0.5ml； 第5排各管加丙型副伤寒杆菌（C）抗原0.5ml。
此 时 各 管 的 病 人 血 清 稀 释 度 又 增 加 一 倍 ， 依 次 为 1:40 ， 1:80 ， 1:160, 1:320，1:640，每管总量1.0ml。 轻轻振荡混匀，置37℃温箱中18～24h，取出观察并记录结果。 观察结果：先观察对照管，应无凝集现象。再从各排第1～5管依 次观察，以能出现明显凝集现象（＋＋）的血清最高稀释度，即 为该血清对某种抗原的凝集效价。“H”抗原呈絮状凝集，“O”抗 原呈颗粒状凝集。分别记录结果，并进行分析。
+
+
－
－+
普通变形杆菌
⊕
－－ +
+
－
－
/+
++
+
+
动力检测
血清学鉴定-玻片凝集
(一)实验目的与原理 用已知抗体（诊断血清）鉴定未知抗原（待检病原菌） (二)实验材料 1、抗体1:10稀释的痢疾杆菌诊断血清。 2、抗原:待检病原菌24小时斜面培养物。 3、其它:生理盐水、载玻片、接种环等 (三)实验方法
实验四 肠道杆菌
一、了解肠道杆菌的形态及染色性 二、熟悉肠道杆菌的培养特性 三、掌握肠道杆菌的生化反应特点
四、掌握血清学试验（玻片凝集、Widal test）
肠道杆菌来自百度文库形态（革兰染色）
粪便标本中沙门菌的分离与鉴定
粪便标本
分离培养（SS、EMB/MAC、BAP） 可疑菌落
初步鉴定：TSI、KIA/MIU、IMViC 多价血清（A-F分群）
杆菌H抗原，与患者血清作定量凝集试验，以检测患者 血清中有无相应抗体，根据抗体含量及增长情况，可辅 助诊断伤寒及副伤寒。 (二)实验材料
试管，吸管。 生理盐水，病人血清，伤寒杆菌O抗原和H抗原，甲 型、乙型、丙型副伤寒杆菌H抗原。 (三)实验方法
取小试管30支，于试管架上排成5排，每排6支，并分别标记 血清稀释度及种类于试管上。
• O凝集价≥ 1：80 • H凝集价≥ 1：160 • 副伤寒H凝集价≥ 1：80
O抗体（IgM）出现较早，维持时间短 H抗体（ IgG ）出现稍晚，维持时间长
最后鉴定
全套生化反应
药敏试验
报告结果
说明：BAP，血琼脂平板； EMB，伊红美兰琼脂培养基； MAC，麦康卡琼脂；TSI， 三糖铁琼脂；KIA/MIU，克 氏双糖/动力试验,吲哚、尿酶 试验管
伊红美兰琼脂培养基（简称EMB）
成分：肉膏汤琼脂（pH7.6） 100ml
磷酸氢二钾
0.2g
乳糖
1g
2%伊红水溶液（灭菌）
1％中性红水溶液 0.25ml
1％煌绿水溶液 0.033ml
功能：抑制大肠埃希菌的生长；伤寒沙门菌、福氏
志贺菌生长良好。
肠道非致病菌（SS培养基） 肠道致病菌（SS培养基）
铁质双糖琼脂培养基（简称KI kligler iron）
成份： 蛋白胨 氯化钠 葡萄糖 乳糖 枸椽酸铁铵 硫代硫酸钠 琼脂 0.2%酚红 蒸馏水
菌名 福氏志贺菌 伤寒沙门菌
常见肠道杆菌的生化反应鉴别表
葡 萄 糖
甘 露 醇
乳 糖
靛 基 质
甲 基 红
VP 试 验
枸 椽
酸 盐
硫 化 氢
尿 素动 分力 解
+
+
－－ /+
+
－
－
－
－－
+
+ －－
+
－
－
/+
+
－+
乙型副伤寒沙 ⊕
⊕－－
+
－
－
++
－
+
门菌
大肠杆菌
⊕ ⊕⊕ +
+
－
－
－
－
+
产气杆菌
⊕ ⊕⊕－ －