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微生物实验报告

题目脓汁和粪便标本中病原菌的检测成绩年级专业

实验者学号

组号小组成员

指导老师

一、实验目的

1. 了解细菌生长的基本营养条件以及培养基的种类。

2. 掌握培养基制备的原则和一般方法。

3. 掌握无菌操作技术。

4. 掌握病原菌的分离与培养方法。

5. 掌握油镜的正确使用。

6. 掌握细菌涂片标本的制备以及革兰氏染色法。

7. 熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。

8. 掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。

9.掌握纸片扩散法检测药物敏感性原理及应用。

10.掌握玻片凝集试验的原理方法、方法、结果观察与判断。

二、实验器材

1．药品与试剂：

营养琼脂粉、营养肉汤粉、半固体琼脂粉、蒸馏水、脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂平板、

伊红美蓝琼脂平板、斜面培养基管、液体培养基管、半固体培养基管、结晶紫染液（第1液）、卢戈氏碘液（第2液）、95%酒精（第3液）、稀释石炭酸复红（第4液）、香柏油、二甲苯、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、诊断血清、Muller-Hinton琼脂平板、青霉素滤纸片、链霉素滤纸片、庆大霉素滤纸片

2. 器材：

1500W电炉、天平、称量纸、药勺、三角烧瓶、量筒、试管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮

纸、硫酸纸、橡皮筋、试管筐、尺、平皿、酒精灯、电炉、接种环、接种针、染色架、吸水纸、

擦镜纸、打火机、笔、显微镜、小砂轮、载玻片、镊子、试管刷、冰箱、恒温培养箱

三、方法与步骤

1、培养基的制备：

培养基称量干粉培

养基(g)

水量(ml) 煮沸(次）分装(ml) 备注

营养琼脂11.4 300 2瓶，500ml 锥形瓶，平

板

营养琼脂 2.9 75 3 5

15支，中试

管，斜面

营养肉汤 1.1 50 1 1 15支小试管，液体

半固体琼脂 1.7 60 3 3 15支，小试管，高层

干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基

不用加热溶解，摇匀即可）

2、细菌的分离培养

平板划线分离法

甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）

丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）

方法：（1)右手拿接种环（如握笔式)，烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；（2)左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与

手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3)立即将已灭冷却的接

种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞; (4)左手斜持平板，

略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5)烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区)；（6)接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7)将培养皿倒置，37°C 培养34小时后，观察结果。

3、细菌的纯培养

斜面接种分工

甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面

丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→ EMB平板→粉红菌落→1支斜面

方法：接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。

4、细菌的形态学检查

涂片→干燥→固定→染色

(1)涂片→干燥→固定

甲→黄色，紫黑。乙→白色，粉红。

丙→黄色，紫黑。丁→白色，粉红。

方法：涂片：①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。

→干燥→固定：手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2?3秒钟。

(2)革兰染色

涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ 95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。

油镜使用方法：10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节

调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。

5、液体培养基接种（肉汤接种）

甲→黄色，乙→白色，

丙→紫黑，丁→粉红。

方法：（1)接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；（2)在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌；（3)标记：组号，颜色

6、细菌的生化试验等

a.细菌的糖发酵试验

甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖

丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖

方法：①用砂轮在糖发酵管液面上方2?3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。③退出接种针，烧灼灭菌。

④管口朝向相同，放置在平皿内。

b.抗菌素敏感性试验

纸片扩散法

甲→黄色菌液乙→白色菌液

丙→紫黑菌液丁→粉红菌液

方法：①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;?作标记：青、先、庆；?镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。

c.血浆凝固酶试验

兔血浆+黄色，白色

方法：①取二滴兔血浆(rabbit plasma)置于洁净的玻片上。②分别用接种环取白色和黄色菌苔(约2?3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8?10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。③菌液

出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。

d.半固体穿刺接种法

甲→白色乙→金黄色

丙→紫黑丁→粉红

方法：①接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针；②管口、接种针经火焰烧灼灭菌；③标记:组号,颜色。

7、细菌的血清学试验、结果分析

玻片凝集试验

方法：（1)取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul; (2)用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于