显微操作技术荧光显微镜技术的特点与应用PPT讲稿
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同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎 宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。
2.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时， 介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减 少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反， 随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加， 使去活化几率增加，则荧光强度下降。
3.荧光强度与溶液浓度的关系
在稀溶液中： F＝Kc F 为荧光强度 K-检 测效率（由仪器决定） c 为液体的浓度高浓度时， 荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线 性关系
4猝灭剂
何为猝灭? 由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而
降低了发光效率的现象叫做猝灭
在荧光物质溶液中,加入某种化合物,使溶液的荧 光强度显著降低,这种化合物称为猝灭剂
荧光增白剂染色
• 荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力,当前常用
的荧光增白剂有ST,M2R,VBL.ST开始被用于显示 细菌,放线菌与真菌的细胞壁,在粘菌材料中,它被 证明与纤维素和几丁质有亲和力
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物的
筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要 的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的 生长代谢过程。
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物的
筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要 的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的
生长代谢过程。
3细胞生活力测定
• 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以
及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利 用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也 无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDA进入活细 胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光 的物质——荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积 累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无 活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光
• 活体染色 vital staining 将无毒或毒性较
小的某种染料注入动物体内,可被机体内某 些组织或细胞所摄取,称为活体...
影响荧光的因素 1. pH的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的 荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=7-12 的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光； 而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离子形式存 在，都不会发出荧光。
1.DNA研究
• 用细胞荧光测定技术测量DNA,是荧光显微技术
和细胞光度技术相结合的产物,标志着前者由定性 向定量测定发展.
吖啶橙
• 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式
C17H19N3 · HCl · ZnCl₂, 分子量 438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤 光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
2.诱发荧光
材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转 化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的 是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为 荧光色团。戊二醛也能诱发荧光
• 3荧光染料染色：
应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组 织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可 被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。 许多常规染色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水 溶性苯胺蓝等)兼有荧光染料的性能
• (3)荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成
分,并且显示的彩色效果很明亮,极易观察,极易进 行定量分析,而且能以极低浓度的染料检测出含量 极微的物质.
• (4) 随着新的荧光染料的发明,可不断扩大被测物
质的范围.
• 生物学材料，有各种产生荧光:
1.自发荧光:或原发荧光
细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生 荧光
可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质显示橘红色荧光
DAPI
• DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-
diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与 DNA强力结合的荧光染料，最大吸收波长为 358nm，最大发射波长为461nm。
DAPI
染色原理：
DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞 核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产 生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双 链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以 看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记 的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。
吖啶橙
• 染色原理:吖啶橙可对细胞中的DNA和RNA同
时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640 （RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双 链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆 积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下，细 胞核发亮绿色荧光（约530nm），胞质RNA发 橘红色荧光（>580nm）。
• 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发
出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料 具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和 RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙 可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均 匀荧光。
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
显微操作技术荧光显微镜技术 的特点与应用课件
荧光显微镜的种类
• 透射式
●落射式
•来自百度文库和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点:
(1)荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的 波长短1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传 统显微镜的分辨率的极限
(2)荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性.它所 用染料的量是极其微小的,只相当于传统显微技术 中染料消耗量的几千分之一.
2.细胞壁研究
荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出 方面,是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生,以 及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化
观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色或利 用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方法是 荧光增白剂染色,在4QOnm左右的激发光照射下观 察细胞壁(纤维素)所产生的绿色荧光来判断细胞壁 的有无
2.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时， 介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减 少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反， 随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加， 使去活化几率增加，则荧光强度下降。
3.荧光强度与溶液浓度的关系
在稀溶液中： F＝Kc F 为荧光强度 K-检 测效率（由仪器决定） c 为液体的浓度高浓度时， 荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线 性关系
4猝灭剂
何为猝灭? 由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而
降低了发光效率的现象叫做猝灭
在荧光物质溶液中,加入某种化合物,使溶液的荧 光强度显著降低,这种化合物称为猝灭剂
荧光增白剂染色
• 荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力,当前常用
的荧光增白剂有ST,M2R,VBL.ST开始被用于显示 细菌,放线菌与真菌的细胞壁,在粘菌材料中,它被 证明与纤维素和几丁质有亲和力
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物的
筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要 的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的 生长代谢过程。
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物的
筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要 的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的
生长代谢过程。
3细胞生活力测定
• 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以
及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利 用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也 无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDA进入活细 胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光 的物质——荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积 累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无 活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光
• 活体染色 vital staining 将无毒或毒性较
小的某种染料注入动物体内,可被机体内某 些组织或细胞所摄取,称为活体...
影响荧光的因素 1. pH的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的 荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=7-12 的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光； 而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离子形式存 在，都不会发出荧光。
1.DNA研究
• 用细胞荧光测定技术测量DNA,是荧光显微技术
和细胞光度技术相结合的产物,标志着前者由定性 向定量测定发展.
吖啶橙
• 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式
C17H19N3 · HCl · ZnCl₂, 分子量 438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤 光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
2.诱发荧光
材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转 化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的 是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为 荧光色团。戊二醛也能诱发荧光
• 3荧光染料染色：
应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组 织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可 被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。 许多常规染色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水 溶性苯胺蓝等)兼有荧光染料的性能
• (3)荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成
分,并且显示的彩色效果很明亮,极易观察,极易进 行定量分析,而且能以极低浓度的染料检测出含量 极微的物质.
• (4) 随着新的荧光染料的发明,可不断扩大被测物
质的范围.
• 生物学材料，有各种产生荧光:
1.自发荧光:或原发荧光
细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生 荧光
可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质显示橘红色荧光
DAPI
• DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-
diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与 DNA强力结合的荧光染料，最大吸收波长为 358nm，最大发射波长为461nm。
DAPI
染色原理：
DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞 核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产 生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双 链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以 看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记 的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。
吖啶橙
• 染色原理:吖啶橙可对细胞中的DNA和RNA同
时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm，荧光发射峰为530nm（DNA）、640 （RNA），它与双链DNA的结合方式是嵌入双 链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆 积在其磷酸根上。在蓝光（502nm）激发下，细 胞核发亮绿色荧光（约530nm），胞质RNA发 橘红色荧光（>580nm）。
• 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发
出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料 具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和 RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙 可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均 匀荧光。
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
显微操作技术荧光显微镜技术 的特点与应用课件
荧光显微镜的种类
• 透射式
●落射式
•来自百度文库和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点:
(1)荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的 波长短1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传 统显微镜的分辨率的极限
(2)荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性.它所 用染料的量是极其微小的,只相当于传统显微技术 中染料消耗量的几千分之一.
2.细胞壁研究
荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出 方面,是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生,以 及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化
观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色或利 用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方法是 荧光增白剂染色,在4QOnm左右的激发光照射下观 察细胞壁(纤维素)所产生的绿色荧光来判断细胞壁 的有无