淡水鱼类细胞培养方法
水产动物遗传育种研究进展
水产动物遗传育种研究进展摘要水产养殖是我国农村经济重要支柱产业之一。
由于长期大规模的人工养殖，已出现了严重的种质退化现象，制约了水产养殖业健康发展。
就目前水产动物优良品种培育所采取的新方法进行概述。
关键词水产动物;育种;转基因;性别控制;杂交育种;细胞工程随着我国水产养殖面积的增加、养殖种类的增多以及生态环境的改变，对水产动物的种质资源的保护、优良苗种的需求尤显重要。
如何获得生长快速、经济性状好、抗病能力强、抗逆性好的优良品种，将成为实现增产、增效的关键。
1转基因技术传统的育种方法是建立在利用种内遗传变异的基础上，而基因转移技术的应用打破了生物种间界限，使育种工作可以充分利用所有可利用的遗传变异，利用人工方法超越自然界亿万年生物进化历程，创造出自然界原来没有的新品种或品系。
转基因动物研究是基因工程技术在动物育种领域中的一次革命。
1985年朱作言等[1-2]将冠以小鼠重金属螯合蛋白基因启动和调控顺序的人GH基因，导入鲫鱼的受精卵，培育出世界上第一批转基因鱼。
到目前为止，国内外已获得几十种转基因鱼，在促进生长、提高鱼类抗逆性、抗病性等方面取得了显著成绩。
转基因水生生物的应用前景:一是快速育种。
传统的育种需经过多代反复选种交配才能育成优良品种。
而转基因技术则可超越自然界的生物进化历程，在短时间内创造出自然界中原来没有的新品种或品系，这是常规育种难以比拟的。
二是改良养殖性状。
转基因鱼的许多优良性状已被实验所证实:如生长速度得到很大提高，即所谓“超级鱼”;有的转基因鱼可提高饵料利用率;有的则表现出较好的抗病性和抗逆性。
三是生产生物医药制品。
通过转基因水生生物来生产生物活性物质以满足医药需要，如研制携带人类胰岛素的转基因鱼以提供胰岛素的研究。
2性别控制动物的性别控制是既古老而又神秘的课题，多少年来人们一直在不停地探索着。
分子遗传学和分子生物技术的飞速发展，使得人们在基因水平上研究动物的性别控制的基因有了可能。
鱼类细胞培养研究进展及应用展望
鱼类细胞培养研究进展及应用展望摘要：鱼类细胞培养技术是一种重要且有潜力的生物学研究技术手段和方法,随着生物技术的发展,越来越多的鱼类细胞系被建立,鱼类细胞培养的具体方法因细胞种类而异,但是总体上有共同之处。
作者针对鱼类细胞培养的发展现状、应用与特点、方法技术进行综述，并为鱼类细胞培养的发展前景作出展望。
关键词：鱼类细胞培养原代培养培养技术鱼类细胞培养作为一种重要的研究手段, 广泛应用于病毒学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学、基因组学、遗传学以及资源保护等方面的研究。
鱼类细胞作为实验对象, 有着活体鱼无法比拟的优点:(1) 成本低, 细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气; (2)重复性好, 实验条件可以精确控制。
因此, 对鱼类细胞系进行深入研究, 无论在理论研究方面, 还是在实际应用方面, 都具有深远意义。
作者对鱼类细胞培养方法与技术、鱼类细胞培养研究进展、鱼类细胞系应用和前景展望进行全面系统的综述。
1、鱼类细胞培养方法鱼类细胞的培养方法包括原代培养和传代培养。
鱼类细胞原代培养的方法包括组织块培养法、机械分离法、络合剂分散法、消化分散法、悬浮细胞培养法、微载体细胞培养法等等。
以上几种方法常常可以配合使用, 如机械分散法可以同时和酶消化法、络合剂分散法使用, 既使用机械分离又使用化学分离, 摸索一个既能有效地分离细胞又对细胞损伤最小的契合点。
络合剂可以络合对消化酶有抑制作用的金属离子, 从而更好发挥酶的作用。
悬浮培养主要用于培养如淋巴细胞、部分肿瘤细胞, 同时需要辅以摇床振荡或者搅拌, 以保持细胞均匀的分散在培养基中。
微载体培养法需要借助微载体来提高细胞产量, 该技术需要生物反应设备, 适合自动化规模化生产[1]。
鱼类细胞培养具有得天独厚的条件: 鱼类细胞培养对传代培养时间、培养温度范围、培养基的选择范围等条件都较哺乳类灵活, 取材更加广泛: 如胚胎组织和幼鱼的各种组织分化程度低, 分裂潜能大, 是原代培养的主要组织来源, 更有优势的是成体鱼的性腺、头肾、后肾、心脏、鳃、鳔、脾脏、鳍条、眼、尾干等组织以及成鱼的肿瘤组织也是常用材料, 并且并不会因为鱼类成年而降低细胞的分裂能力, 鱼类细胞平均传代 100 代仍可以继续分裂, 比起哺乳类, 鱼类的有丝分裂极限要大得多, 并且鱼类细胞系每一代细胞的存活期均较长;人和哺乳动物离体培养的正常二倍体细胞株寿命均有限, 一般不超过 50 代。
一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法[发明专利]
![一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8e79530242323968011ca300a6c30c225901f092.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.05.29C N 103122333 A (21)申请号 201310037191.4(22)申请日 2013.01.31C12N 5/071(2010.01)(71)申请人浙江工商大学地址310018 浙江省杭州市江干区下沙高教园区学正街18号(72)发明人王彦波 傅玲琳(74)专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司 33100代理人黎双华(54)发明名称一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法(57)摘要本发明公开了一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，包括鳃上皮组织的取样、制备培养液、组织块培养、鳃上皮细胞的纯化、鳃上皮细胞的传代培养的步骤。
本发明对异育银鲫鳃上皮细胞的分离、培养和纯化等培养过程，和培养液的成分进行了改进。
根据本发明异育银鲫鳃上皮细胞的原代培养方法，培养至细胞间正常衔接时间可缩短为48h ，大大缩短了培养时间，所建立的异育银鲫鳃上皮细胞模型可用于外源物质的细胞毒性、离子交换规律等相关研究，并为这些研究提供了便利。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页(10)申请公布号CN 103122333 A*CN103122333A*1/1页1.一种异育银鲫鳃上皮细胞的分离、纯化、培养和传代方法，其特征是包括以下步骤：(1) 鳃上皮组织的取样：选取50-100g 的健康异育银鲫禁食24h 后经麻醉，放入70％乙醇中消毒l min ；在无菌室中取出鳃，用磷酸盐缓冲液冲洗数次，去除鳃黏液，将鳃剪碎得体积为0.9-1.1 mm 3的组织块，备用；(2) 制备培养液：在每毫升DMEM 培养基中添加0.1μg 上皮细胞生长因子、0.1IU 胰岛素、100IU 青霉素、100μg 链霉素和0.1ml 胎牛血清；(3) 组织块培养：在步骤(1)得到的异育银鲫鳃组织块中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振荡消化20min ，吸管反复吹打直到光镜下出现大量细胞及细胞团，并加入含5％胎牛血清的DMEM 终止消化，1000 r/min 离心5 min ，弃上清液，加入步骤(2)的培养液制得细胞悬液，再将其接种至24孔板培养，置25-30℃，5％CO 2培养箱培养；培养90 min 后，把培养液连同未贴壁的细胞转入新的培养板继续培养，培养至细胞覆盖80%板底表面积时，得到原代培养的鳃上皮细胞；(4) 鳃上皮细胞的纯化：采用反复贴壁法，将步骤(3)得到的鳃上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度至5×104 /ml ，种植在细胞培养瓶中，置25-30℃，5％CO 2培养箱培养；待细胞铺展到板底80%时，再依次重复1-2次，得到预纯化鳃上皮细胞；去除培养基，并用Hanks 液冲洗，随后加入质量浓度为0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸混合消化液，至倒置显微镜下观察80-90%细胞回缩时终止，得到纯化后的鳃上皮细胞；(5)鳃上皮细胞的传代培养：将步骤(4)纯化后的鳃上皮细胞离心，并用培养液清洗细胞2-3遍，去掉上清，用培养液重新悬浮细胞，以5×104 /ml 的密度植入培养瓶中于25-30℃，5％CO 2培养箱培养，隔日更换培养液。
鱼类育种学概述
鱼类育种学概述摘要：鱼类遗传育种的途径和范围是非常广泛的，包括常规的选择育种、杂交育种、多倍体育种以及新近发展起来的细胞工程育种和转基因育种。
本文就这些方面对鱼类的育种进行综述。
关键词：选择育种杂交育种多倍体育种细胞工程育种转基因育种鱼类育种是对野生或现有品种进行遗传改造，创造自然界所未有的鱼类新品种，是对鱼类多样性和物种进化的贡献。
20世纪70年代以后，鱼类育种与细胞工程和基因工程等新高生物技术的结合，使这一研究领域很快出现生机，冲破了多年来常规的选择育种和杂交育种在育种多样性和快速高效等方面的制约。
我国较大规模开展鱼类遗传育种研究的历史仅有20多年。
短短20多年来，不但在育种技术方面取得了重大进步，建立了杂交、倍性、细胞工程以及基因工程等多种育种技术，并逐渐形成了多种技术综合配套的技术路线。
通过传统的育种技术和现代的育种技术成功地培育出新的鱼类品种，如工程鲫、工程鲤等，不断向社会推出了许多具有重要经济价值的养殖新对象，大大提高了鱼类的生产力，丰富了鱼类的遗传多样性。
鱼类遗传多样性的丰富反过来又可增加鱼类生产量和改良鱼类品种，因此，保护基因多样性和可持续的利用是人类维持基本的生命过程和生命支持系统的基础。
1 选择育种选择育种是育种工作的一个最基本的手段[1,2]。
改变育种对象遗传性质的常规方法有两种：一是挑选作为亲本用的个体，这就是选择。
另一个是控制亲本的交配方式，这就是遗传操作。
在鱼类生长发育的各个阶段，可以有目的地选择具有优良性状的个体，淘汰品质不良的个体，这种方法可以避免由于鱼类人工繁殖所产生的近亲交配而随之引起的退化现象。
目前，系统选育的方法通常有4种：(1)混合选种(又称集团选种)，即从生产效果最好的池塘中选出鱼群，这种方法在鱼类的各个发育阶段都可进行；(2)家系选种(又称窝选)，即从一雌一雄选亲配合建立家系开始，在其后代中一代一代进行高度的近亲交配，以累代实行严格的全同胞交配为基础，依据个体表型值，兼顾家系平均值，进行选择留种；(3)亲本选种，又称后裔鉴定选种，即根据后代质量而对亲本作出评价的个体选择方法，根据后裔鉴定结果决定对亲本的取舍；(4)综合选种，即综合上述几种选种方法进行的选择育。
生态学期末复习整理版
单选题、判断改错题、简答题、计算题、资料分析题1.生态学：是研究有机体与环境相互关系的科学，环境包括非生物环境和生物环境。
2.赫克尔（Haeckel）（1866）强调有机体与生物环境的相互作用和有机体之间的相互作用。
3.“生态学”一词经武汉大学张挺教授介绍到我国。
4.我国著名生态学家马世俊认为生态学是研究生命系统与环境系统相互关系的科学。
提出社会-经济-自然复合生态系统的概念。
5.生态学研究对象：个体、种群、群落、生态系统。
6.生态学研究方法：野外的、实验的和理论的三大类。
7.生态因子：是指环境要素中对生物起作用的因子，如光照、温度、水分、二氧化碳、食物、其他生物。
8.生物与环境的相互作用是作用与反作用。
作用：环境的非生物因子对生物的影响。
反作用：生物对环境的影响。
9.生态因子分类：（1）按性质：气候因子、土壤因子、地形因子、生物因子、人为因子；（2）按有无生命的特征：生物因子、非生物因子；（3）按生态因子对动物种群数量变动的作用：密度制约因子、非密度制约因子；（4）按生态因子的稳定性及其作用特点：稳定因子、变动因子。
10.生态因子作用特征：（1）综合作用（2）主导因子作用（3）阶段性作用（4）不可替代性和补偿性作用（5）直接和间接作用11.生物与环境的相互作用生物与环境的关系是相互的和辩证的。
环境作用于生物，生物又反作用于环境，两者相辅相成。
○1环境的非生物因子对生物的影响，一般称为作用。
环境对生物的作用是多方面的，可影响生物的生长、发育、繁殖和行为；影响生物生育力和死亡率，导致种群数量的改变；某些生态因子能够限制生物的分布区域。
例如热带动植物不能在北半球的北方生长。
生物并不是消极被动地对待环境的作用，它也可以从自身的形态、生理、行为等方面不断进行调整，积极地利用某些生态因子的周期性变化以适应环境中的生态因子变化,将其限制作用减小。
○2生物对环境的影响，一般称为反作用。
生物对环境的反作用表现在改变了生态因子的状况。
鳙鱼的正确养殖方法有哪些
鳙鱼的正确养殖方法有哪些鳙鱼也叫做花鲢、胖头鱼、包头鱼、大头鱼等等鳙鱼是淡水鱼的一种，鳙鱼也是中国四大家鱼之一。
不过很多人都不知道鳙鱼要怎么养。
以下就是店铺做的鳙鱼的饲养方法整理，希望对你们有用。
鳙鱼的养殖技术苗种放养以往湖泊、水库鳙鱼的放养规格一般是13.2㎝左右大规格鱼种，在现代技术条件下，要求0.15—0.5公斤/尾甚至1.0kg大规格鱼种。
放养时间：应选择在水温5～10℃的冬季或初春时进行。
此时有利于鱼种的高密度运输，可以减轻运输中的伤亡;鱼种和凶猛鱼类的活动能力减弱，凶猛鱼类对放养鱼种的危害也相对减轻。
放养地点：应选择在水库上游水浅、避风、向阳的肥沃库湾处。
这样，远离水库下游的溢洪道、泄洪洞，放养鱼种的逃逸机会可以减少，对大水面环境的适应时间可以缩短，生长可以加快，存活率可得到提高。
放养天气：应选择在风和日丽的日子，不要在刮大风、下雪、结冰的日子放养。
检疫与消毒：鱼种放养入库前必须进行鱼病检疫和鱼种消毒。
严禁放养带有传染病的鱼种入库。
精心操作：经长途运输的鱼种运到水库后，应先用库水缓缓加进装鱼容器中，待容器内水温与库水温差不大时，再将鱼种慢慢地投放入库。
鱼种放库后，放养人员还应站在库边或船上，用船桨轻轻地搅动库水，缓缓地驱赶鱼种游向大水面。
养殖模式传统的鲢、鳙鱼搭配比例是3:1，也就是3鲢带1鳙，分别是75%和25%。
根据生产实践，鲢鳙鱼的放养结构中，鳙鱼的比例小于20%或鲢鱼的比例大于80%，鳙鱼的生长速度都较快，当鲢的放养比例在20%—80%之间时会抑制鳙鱼的生长速度。
鳙鱼作为主养鱼时应少量的搭配或不放养鲢鱼。
水质调控调节水质有三大功能：一是改良水质。
微生态制剂中的有益菌进入水体后，发挥其氧化、氨化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用，迅速分解养殖动物的排泄物、残存饲料、动物残骸等有机物，有效降低了水体氨氮和亚硝酸盐浓度;二是有机物分解后的盐类为单细胞藻类生长繁殖提供了良好的生态环境为单胞藻类生长繁殖提供营养，而单胞藻类的光合作用又为有机物的氧化分解及养殖生物的呼吸提供了溶解氧，构成一个良性的生态循环，维持和营造了良好的水质条件，能够长期保持水质的稳定，达到水肥、稳定从而有利于养殖对象健康生长。
鲤鱼吻端和尾鳍细胞的生长形态及增殖能力比较研究
２ ０ ０多个 ｊ ． 我 国对 于 鱼类细 胞培 养 的研 究始 于 ２ ０世纪 ７ ｏ年 代 ， 自张念 慈 等＿ ５ 报道 了草鱼 吻 端组 织二 倍 体
细胞 株 Ｚ Ｃ 一 ７ ９ ０ １ 及其 亚株 Ｚ Ｃ 一 ７ ９ ０ １ Ｓ １的建立 以来 ， 左 文 功 等 又报 道 了草 鱼 肾脏 组 织 细胞 系 Ｃ Ｉ Ｋ 的建 立． 李焕 林 等 报 道 了草鱼 吻端成 纤维 细胞 系 Ｐ Ｓ Ｆ的建立 ． 迄 今 已经 建立 的细 胞 系有 ３ ０多株 ， 细 胞 系的取 材 和 鱼种 也 不 断 丰富 ， 如樊 廷 俊 等 建 立 了大 菱 鲆 鳍 细胞 系 ， 任 国诚 等 建 立 了半 滑舌 鳎 肝 脏 细胞 系 ， 王 贤 丽
略强 于 吻端 细 胞 ， 因此 鲤 鱼 尾 鳍 组 织 是 较 适 宜 的 成 纤 维 细胞 体外 培养 材 料 ．
关键 词 ： 鲤鱼 ； 尾 鳍 ；吻 端 ； 细 胞 培 养
中 图 分 类 号 ：Ｑ ９ ５ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ １ － ８ ７ ３ ５ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １ －０ ０ ６ ８ －０ ３
第４ ２卷 第 １ 期
２ ０ １ ３年 １月
内蒙 古 师 范 大 学 学 报 （ 自然科 学汉 文 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｎ ｅ ｒ Ｍｏ ｎ ｇ ｏ ｌ ｉ ａ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
细胞 培养 的相 关资料 ．
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
实验 用鱼 来源 于地方 水产批 发 市场 ， 要求幼 龄 、 健康 ．
鱼类的种类和鱼类养殖
鱼类的种类和鱼类养殖鱼类是一类生活在水中的脊椎动物，具有各种各样的种类。
它们在水生生态系统中起着至关重要的作用，不仅作为食物链中的重要一环，还给人们提供了丰富的食物资源。
因此，鱼类的种类和养殖技术对于人们的生活和经济发展有着重要的意义。
鱼类的种类鱼类的种类繁多，有来自淡水和海水的鱼类。
下面将介绍一些常见的鱼类种类：1. 淡水鱼类淡水鱼类是生活在淡水环境中的鱼类。
常见的淡水鱼类包括鲤鱼、鲫鱼、草鱼等。
这些鱼类具有良好的适应性和生长能力，是人们常见的食用鱼类资源。
2. 海水鱼类海水鱼类是生活在海洋环境中的鱼类。
世界上有各种各样的海水鱼类，它们的形态、颜色和生活习性各不相同。
常见的海水鱼类有比目鱼、鳕鱼、金枪鱼等。
这些鱼类不仅作为食物资源，还具有较高的经济价值。
3. 优势鱼类优势鱼类是指能够在特定水域中迅速繁殖和适应环境的鱼类。
常见的优势鱼类包括鲤鱼、罗非鱼等。
这些鱼类适应性强，繁殖能力强，被广泛用于人工养殖。
鱼类养殖技术鱼类养殖是指通过人工方式在特定的水域中饲养和繁殖鱼类。
有效地开展鱼类养殖可以提供丰富的鱼类资源，满足人们的日常需求和经济发展。
以下是一些常见的鱼类养殖技术：1. 池塘养殖池塘养殖是指在特定的水域中建设池塘，利用池塘中的水资源和生态环境进行鱼类的养殖。
对于淡水鱼类的养殖来说，池塘养殖是一种常见且成本较低的方式。
2. 水族箱养殖水族箱养殖是指在人造水环境中使用水族箱进行鱼类的养殖。
这种养殖方式适用于一些热带鱼和观赏鱼的养殖，可以满足人们对于观赏鱼的需求。
3. 海水养殖海水养殖是指利用海洋环境进行鱼类的养殖。
这需要建立合适的养殖场所，并且需要掌握一定的技术和管理方法。
海水养殖通常用于一些高经济价值的海水鱼类的养殖，例如金枪鱼。
4. 组织培养养殖技术组织培养养殖技术是指通过细胞培养的方式进行鱼类的繁殖和养殖。
这种技术可以大大提高鱼类的繁殖效率和品质，并且可以帮助保护鱼类资源。
总结：鱼类作为重要的水生生物资源，在人们的生活和经济发展中扮演着重要角色。
《鱼类增养殖学》课件
鱼类增养殖学经历了从传统养殖到现代集约化养殖的发展过程，技术和管理水平不断提高。
现状
目前，全球鱼类增养殖业发展迅速，成为重要的水产资源供应途径。同时，面临环境压力、病害防治等问题，需 要加强科技创新和规范化管理。
02
鱼类增养殖的基本原理
鱼类繁殖原理
鱼类繁殖方式
鱼类繁殖方式包括卵生、卵胎生 和胎生，每种繁殖方式都有其特
维护生态平衡
合理的鱼类增养殖可以优化水域生态结构，提高水域生产力，维护生 态平衡。
传承渔业文化
鱼类增养殖业的发展可以传承和弘扬渔业文化，丰富人们的精神生活 。
鱼类增养殖的未来发展趋势
科技创新驱动
加强鱼类增养殖的科技创新， 研发新品种、新技术和新模式 ，提高养殖效益和资源利用率
。
生态优先
坚持生态优先原则，实现鱼类 增养殖与生态环境的协调发展 ，保障水域生态安全。
产业融合发展
推动鱼类增养殖业与相关产业 的融合发展，形成完整的产业 链条，提升产业整体竞争力。
国际化合作
加强国际合作与交流，引进国 外先进技术和管理经验，提高 我国鱼类增养殖业的国际地位
。
05
总结与展望
总结
01
鱼类增养殖学发展历程
从最早的鱼类捕捞，到人工繁殖，再到增养殖技术的广泛应用，鱼类增
养殖学经历了漫长的发展过程。
环境友好型养殖
注重生态平衡和环境保护，发展可持 续的养殖模式，减少对自然环境的负 面影响。
加强国际合作
加强与其他国家和地区的合作与交流 ，共同推进鱼类增养殖学强学科建设和教育 普及，为鱼类增养殖学的发展提供更 多优秀人才。
THANKS
鱼类生长环境对鱼体的生长速度和健 康状况有重要影响，包括水温、水质 、食物供应等。
无菌斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒模型的建立
生物技术进展２０１９年㊀第９卷㊀第４期㊀３６９~３７４ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０１９￣０３￣０４ꎻ接受日期:２０１９￣０５￣０７㊀基金项目:国家自然科学基金项目(３１６０２１６９)ꎻ中国农业科学院基本科研业务费所级统筹项目(１６１０３８２０１７００８)资助ꎮ㊀作者简介:谢亚东ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为鱼类消化道微生物学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:２９１６６５４５６＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ∗通信作者:周志刚ꎬ研究员ꎬ博士ꎬ研究方向为水产生物技术ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈｏｕｚｈｉｇａｎｇ０３＠ｃａａｓ.ｃｎ无菌斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒模型的建立谢亚东ꎬ㊀解明旭ꎬ㊀李㊀解ꎬ㊀王安然ꎬ㊀杨培龙ꎬ㊀冉㊀超ꎬ㊀周志刚∗中国农业科学院饲料研究所ꎬ农业农村部饲料生物技术重点实验室ꎬ北京１０００８１摘㊀要:我国水产养殖业受病毒危害严重ꎬ但目前尚无有效的应对手段ꎮ近年来研究证实ꎬ肠道菌群是宿主和病毒互作的参与者ꎬ然而鱼类的相关研究较少ꎮ无菌动物感染模型是研究肠道菌群相关功能的前提ꎮ基于此ꎬ以模式生物斑马鱼为研究对象ꎬ建立了稳定的无菌斑马鱼鲤春病毒血症病毒(ｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓꎬＳＶＣＶ)感染模型ꎬ并利用该感染模型探究斑马鱼肠道菌群和３株代表性的肠道土著菌对病毒感染的影响ꎬ包括鲸杆菌(Ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｏｍｅｒａｅ)㊁维氏气单胞菌(Ａｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉ)及类志贺邻单胞菌(Ｐｌｅｓｉｍｏｎａｓｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ)ꎮ研究结果显示ꎬ经菌鱼互作２４ｈꎬ未观察到肠道菌群和代表菌株对病毒感染的影响ꎮ无菌斑马鱼病毒感染模型的建立为快速筛选影响病毒感染的菌株提供了一条新的途径ꎬ并为进一步探寻和开发细菌的潜在抗病毒效应元件提供了可能ꎮ关键词:无菌斑马鱼ꎻ病毒感染模型ꎻ鲤春病毒血症病毒ꎻ肠道菌群ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０１９.００２０ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａＧｅｒｍ￣ｆｒｅｅＺｅｂｒａｆｉｓｈＭｏｄｅｌｆｏｒＳｐｒｉｎｇＶｉｒａｅｍｉａｏｆＣａｒｐＶｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎＸＩＥＹａｄｏｎｇꎬＸＩＥＭｉｎｇｘｕꎬＬＩＪｉｅꎬＷＡＮＧＡｎｒａｎꎬＹＡＮＧＰｅｉｌｏｎｇꎬＲＡＮＣｈａｏꎬＺＨＯＵＺｈｉｇａｎｇ∗ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦｅｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＦｅｅｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＶｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｃａｕｓｅｓｅｒｉｏｕｓｄａｍａｇｅｓｔｏＣｈｉｎｅｓｅａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｓｔｒｙꎬｂｕｔｔｈｅｒｅｉｓｎｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｙｅｔ.Ｒｅｃｅｎｔｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｉｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｈｏｓｔａｎｄｖｉｒｕｓｅｓ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｒｅａｒｅｒａｒｅｒｅｌａｔｅｄｓｔｕｄｉｅｓｏｎｆｉｓｈ.Ｇｅｒｍ￣ｆｒｅｅ(ＧＦ)ａｎｉｍａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌｉｓｔｈｅｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ￣ｒｅｌａｔｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ.ＢａｓｅｄｏｎｔｈｉｓꎬａｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅＧＦｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌｆｏｒｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓ(ＳＶＣＶ)ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ.Ｆｕｒｔｈｅｒꎬｔｈｉｓｍｏｄｅｌｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａａｎｄ３ｓｔｒａｉｎｓｏｆｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｃｏｍｍｅｎｓａｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇＣｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｏｍｅｒａｅꎬＡｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉａｎｄＰｌｅｓｉｍｏｎａｓｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓꎬｏｎｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｏｒｃｏｍｍｅｎｓａｌｂａｃｔｅｒｉａｏｎＳＶＣＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｂａｃｔｅｒｉａｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｏｆｆｉｓｈｏｖｅｒ２４ｈ.ＴｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａＧＦｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌｆｏｒＳＶＣＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｗａｙｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｔｈｅｓｔｕｄｙａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅｄａｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｃｏｍｍｅｎｓａｌｂａｃｔｅｒｉａｏｆｆｉｓｈ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｇｅｒｍ￣ｆｒｅｅｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌꎻｓｐｒｉｎｇｖｉｒａｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓꎻｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ㊀㊀水生动物的疾病可分为病毒病㊁细菌病㊁真菌病和寄生虫病等[１]ꎬ其中ꎬ病毒病爆发迅速㊁传染性极强ꎬ且目前尚无特别有效的手段应对ꎬ但其产生的危害往往极为严重ꎮ在我国大宗淡水鱼养殖中造成严重危害的病毒主要有４种:鲫鱼造血器官坏死病病毒(ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ￣２ꎬＣｙＨＶ￣２)㊁鲤春病毒血症病毒(ｓｐｒｉｎｇｖｉｒｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓꎬＳＶＣＶ)㊁锦鲤疱疹病毒(ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ￣３ꎬＣｙ￣ＨＶ￣３)㊁草鱼呼肠弧病毒(ｇｒａｓｓｃａｒｐｒｅｏｖｉｒｕｓꎬＧＣＲＶ)ꎮ其中ꎬＳＶＣＶ宿主范围较广ꎬ主要是鲤科. All Rights Reserved.鱼类ꎬ其可以感染所有年龄的鲤鱼ꎬ且年龄越小越易患病ꎬ１龄仔鱼死亡率达７０％以上[２]ꎮ其多通过水平传播ꎬ经鳃进入鱼体ꎬ随后传播到肾脏㊁肝脏㊁脾脏㊁心脏和胃肠道[３]ꎮＳＶＣＶ被世界动物卫生组织列为必须申报的疾病ꎬ我国农业农村部也将其列为«中华人民共和国进境动物一㊁二类传染病㊁寄生虫病名录»(２００８)中的二类动物疫病ꎮ因此ꎬ深入研究ＳＶＣＶ对于疾病的检测㊁预防ꎬ特别是开发相关疫苗及诊断试剂具有重要意义[２]ꎮ斑马鱼(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)是一种水生脊椎动物ꎬ具有完善的先天免疫系统和适应性免疫系统ꎬ对ＳＶＣＶ易感ꎬ且通过注射和浸浴两种途径均可感染ꎬ所以近年来多借助斑马鱼来探究ＳＶＣＶ感染机制和发病机理[４~６]ꎮ传统的病毒学家们普遍认为病毒感染机体是一个双向过程ꎬ除病毒和机体的免疫系统以外没有其他因素参与ꎮ如今ꎬ已有研究证明ꎬ某些病毒在其所感染的宿主肠道的黏膜区域同共生菌群有着直接的㊁特殊的相互作用ꎬ说明共生菌群是病毒感染机体的第３个参与者ꎬ影响着宿主和病毒的相互作用[７ꎬ８]ꎮ此前的研究中ꎬ在不同的病毒类型和感染模型中ꎬ共生菌群对病毒的致病性具有促进或抵抗的作用ꎬ表明宿主－菌群－病毒三者之间的相互作用机制的明晰需要更为深入的研究[８]ꎮ已有的水生动物肠道菌群和病毒感染的相互关系的研究较少ꎮ目前有部分研究表明益生菌在水产动物中具有抗病毒作用ꎮ如通过饲喂橄榄牙鲆乳酸菌和芽孢杆菌可控制淋巴囊肿病病毒(ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓꎬＬＣＤＶ)的感染[９]ꎻ在虹鳟肠道中也已经分离出了具有良好抗病毒特性的嗜冷益生菌乳酸乳球菌和气单胞菌亚种[１０ꎬ１１]ꎮ此外ꎬ研究表明ꎬ弧菌属(Ｖｉｂｒｉｏｓ)㊁假单孢菌属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)㊁气单胞菌属(Ａｅｒｏｍｏｎａｓ)的某些菌种对鲑科(Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ)鱼类的传染性造血组织坏死病毒(ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓꎬＩＨＮＶ)具有拮抗作用ꎬ具体机制可能涉及拮抗化合物的产生ꎻ同时ꎬ从鲑鱼孵化场分离的波氏假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｕｎｄｉｎａ)菌株也具有抗病毒效果ꎬ可以提高实验室条件下感染拟鯵神经坏死病毒(Ｓｈｉｍａ￣ａｊｉｎｅｕｒｏｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓꎬＳＪＮＮＶ)㊁杆状病毒(ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ)和虹彩病毒(ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ)后的南美白对虾和褐鳟的存活率[１２]ꎮ从虾孵化场分离的２种弧菌可以抑制马苏大麻哈鱼病毒(Ｏｎ￣ｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓｍａｓｏｕｖｉｒｕｓꎬＯＭＶ)和ＩＨＮＶ的感染ꎬ有望作为抗病毒剂使用[１３]ꎮ综上所述ꎬ来源于水产养殖环境和养殖动物肠道的细菌均可发挥抵抗病毒感染的效果ꎬ说明有必要深入系统地研究肠道菌群和肠道土著菌株在鱼类宿主病毒感染中发挥的作用ꎮ然而ꎬ系统研究菌群在抗病毒感染中的作用需要无菌动物模型ꎮ本研究以斑马鱼为研究对象ꎬ摸索建立无菌斑马鱼的ＳＶＣＶ感染模型ꎬ并利用菌群和单菌转接技术初步探究肠道菌群和代表性的肠道土著菌株对斑马鱼抗病毒感染能力的影响ꎬ以期为后续深入研究鱼类宿主－菌群－病毒的三元作用机制提供技术和模型ꎬ并为筛选抗病毒菌株和活性元件提供技术平台ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料本实验生产无菌斑马鱼所使用的是实验室培养的ＴＵ纯系亲鱼ꎮ鲤鱼上皮瘤细胞(ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａｐａｐｕｌｏｓｕｍｃｙｐｒｉｎｉꎬＥＰＣ)以及－８０ħ冻存的ＳＶＣＶ病毒种子从华中农业大学水产学院袁军法课题组获得ꎮ鲸杆菌(Ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｏｍｅｒａｅ)㊁维氏气单胞菌(Ａｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉ)和类志贺邻单胞菌(Ｐｌｅｓｉ￣ｍｏｎａｓｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ)菌株均为本实验室自斑马鱼体内分离纯化所得ꎮＧＺＭ溶液:１Ｌ无菌水中加入１.５ｍＬ海盐原液(４０ｇ/Ｌ)ꎬ混匀后高压灭菌ꎮＡＢ￣ＧＺＭ溶液:向４９.６ｍＬ无菌ＧＺＭ溶液中ꎬ依次加入５０μＬ两性霉素Ｂ母液(２５０μｇ/ｍＬꎬ过０.２２μｍ滤膜滤灭)㊁２５μＬ卡那霉素母液(１０ｍｇ/ｍＬꎬ过０.２２μｍ滤膜滤灭)㊁２５０μＬ氨苄霉素母液(２０ｍｇ/ｍＬꎬ过０.２２μｍ滤膜滤灭)㊁５００μＬ青链霉素母液(１Ｕ/μＬꎬ过０.２２μｍ滤膜滤灭)ꎬ现用现配ꎮ１.２㊀细胞培养ＥＰＣ细胞的培养基为添加了１０％胎牛血清(ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍꎬＦＢＳ)和１００Ｕ/ｍＬ青霉素和链霉素的最低必需培养基(ｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅ￣ｄｉｕｍꎬＭＥＭ)ꎮ细胞培养箱设置为２５ħꎬ５％ＣＯ２ꎮ按照上述方法将ＥＰＣ细胞培养在７５ｃｍ２细胞培养瓶中ꎬ当培养瓶中的细胞覆盖率达到８０％时ꎬ０７３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.取出培养基并加入２ｍＬ０.２５％胰蛋白酶消化液ꎬ孵育３~５ｍｉｎꎬ将细胞从培养瓶中分离出来ꎬ按照１ʒ３的比例传代ꎮ１.３㊀病毒增殖待７５ｃｍ２培养瓶中的ＥＰＣ覆盖率达到９０％时吸出培养基ꎬ再用无ＦＢＳ的ＭＥＭ培养基清洗细胞１次ꎬ然后吸出培养基ꎮ将ＳＶＣＶ病毒种子(约１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)置于冰上解冻ꎬ取２μＬ稀释到５ｍＬＭＥＭ培养基中ꎮ将稀释的含病毒种子的培养基加入培养瓶中ꎬ置于２５ħ的ＣＯ２培养箱中培养１ｈꎬ每隔１５ｍｉｎ轻轻摇一下培养瓶ꎮ随后吸出含病毒种子的培养基ꎬ加入适量ＭＥＭ培养基(约１０ｍＬ)进行细胞培养ꎬ增殖病毒ꎮ直到致细胞病变效应(ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔꎬＣＰＥ)上升至８０％ꎬ将细胞瓶置于－８０ħ中ꎬ反复冻融３次ꎬ将病毒从细胞中释放出来ꎮ随后将细胞裂解液经１２０００ｇ常温离心２０ｍｉｎꎬ收集上清液转移到新的试管中ꎬ－８０ħ储存备用ꎮ１.４㊀引物设计与合成Ｇ蛋白参与病毒内吞作用[１５]ꎬ是ＳＶＣＶ最主要的免疫原性蛋白ꎬ也是疫苗和诊断试剂研制的重要靶蛋白ꎮ因而ꎬ参照Ｌｉｕ等[１４]的方法建立ＳＶＣＶ病毒糖蛋白(Ｇ蛋白)定量检测体系ꎮ实验所用引物序列见表１ꎬ引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ用于病毒基因克隆㊁病毒定量检测ꎮ表１㊀引物名称及序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ.目的基因引物名称序列(５ᶄң３ᶄ)用途ＳＶＣＶＧ蛋白基因ＳＶＣＶ￣Ｆ５ᶄ￣ＴＧＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＴＧＣＡＣＴＴＡＴＹＴ￣３ᶄＳＶＣＶ￣Ｒ５ᶄ￣ＴＣＡＡＡＣＫＡＡＲＧＡＣＣＧＣＡＴＴＴＣＧ￣３ᶄＳＶＣＶ￣Ｐ５ᶄ￣ＦＡＭ￣ＡＴＧＡＡＧＡＲＧＡＧＴＡＡＡＣＫＧＣＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡ￣ＴＡＭＲＡ￣３ᶄ病毒基因克隆㊁定量检测病毒基因定量检测１.５㊀病毒定量检测１.５.１㊀标准质粒的构建㊀参照Ｌｉｕ等[１４]的方法ꎬ以ｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ作为ＳＶＣＶ拷贝数校准的标准质粒ꎬ其中ꎬｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ是将ＳＶＣＶＧ蛋白基因扩增后的产物插入ｐＬＢ载体(天根生化科技(北京)有限公司)中产生的ꎬ并在ＤＨ５α高效的感受态细胞中进行增殖ꎮ测量质粒ＤＮＡ纯化后的ＯＤ２６０ꎬ调整拷贝数到１０１０ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ在此基础上ꎬ连续稀释ꎬ得到１０~１０９ｃｏｐｉｅｓ/μＬ的标准质粒ꎬ用作ＲＴ￣ＰＣＲ测定的标准量化ＳＶＣＶꎮ１.５.２㊀多通道实时定量ＰＣＲ检测病毒载量㊀使用天根生化科技(北京)有限公司病毒ＲＮＡ提取试剂盒提取１.３中增殖病毒上清液ＲＮＡꎬ使用第一链ｃＤＮＡ合成试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)反转录为ｃＤＮＡ后ꎬ以其为模板ꎬ同１０~１０１０ｃｏｐｉｅｓ/μＬ的标准质粒一同进行多通道实时定量ＰＣＲ(ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎꎬｍｑＲＴ￣ＰＣＲ)检测ꎮ反应体系(２０μＬ)为:ｃＤＮＡ/标准质粒１μＬꎬ１０μｍｏｌ/ＬＳＶＣＶ￣Ｆ０.５μＬꎬ１０μｍｏｌ/ＬＳＶＣＶ￣Ｒ０.５μＬꎬ１０μｍｏｌ/ＬＳＶＣＶ￣Ｐ０.５μＬꎬＫＡＰＡＰＲＯＢＥＦＡＳＴｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬꎬＲＮＡａｓｅ￣ｆｒｅｅＨ２Ｏ７.５μＬꎮ反应程序为:９５ħ１ｍｉｎꎻ９５ħ３ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ共４０个循环ꎮ１.６㊀无菌斑马鱼制备参照Ｐｈａｍ等[１６]的方法ꎬ制备无菌斑马鱼ꎮ将亲鱼从本实验室正常养殖体系中捞出ꎬ产卵前一天晚上将亲鱼按雌雄配比１ʒ１(或２ʒ１)放入孵化缸中ꎬ用挡板隔开ꎬ次日上午８:００拉开挡板ꎬ让亲鱼自然交配产卵ꎮ亲鱼产卵后２ｈ内收集受精卵至平皿中ꎬ用清水漂洗受精卵１~２次ꎮ再用ＡＢ￣ＧＺＭ清洗受精卵３次ꎬ将受精卵转移至５０ｍＬ锥形管中ꎬ用ＡＢ￣ＧＺＭ浸泡４.５ｈꎮ随后ꎬ用ＧＺＭ漂洗受精卵３次ꎬ将受精卵转移至０.０５％的聚维酮碘(ｐｏｖｉｄｏｎｅ￣ｉｏｄｉｎｅꎬＰＶＰ￣Ｉ)中ꎬ浸泡４５ｓ后ꎬ用ＧＺＭ漂洗受精卵３次ꎬ再将受精卵转移至０.００２％的ＮａＣｌＯ中ꎬ浸泡１０ｍｉｎꎮ最后ꎬ用ＧＺＭ漂洗受精卵３次ꎬ将受精卵转移至培养瓶中ꎬ３０ｍＬＧＺＭ培养液放入约３０个卵ꎮ置于２８ħ孵化ꎬ光照周期１４ｈ黑暗㊁１０ｈ光照ꎮ等到３ｄｐｆ(受精后的天数ꎬｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａ￣ｔｉｏｎ)ꎬ用胰酪大豆胨琼脂(ｔｒｙｐｔｉｃｓｏｙｔｏｎｅａｇａｒꎬＴＳＡ)平板检测培养液是否染菌ꎬ将染菌的瓶从实验中剔除ꎮ１７３谢亚东ꎬ等:无菌斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒模型的建立. All Rights Reserved.１.７㊀无菌斑马鱼浸浴攻毒条件测定在１.６的基础上ꎬ４ｄｐｆ时ꎬ更换ＧＺＭꎬ并将无菌斑马鱼转移至２２ħ光照培养箱中过夜ꎮ随后吸出ＧＺＭ至剩余１０ｍＬꎬ实验组加入５ｍＬＳＶＣＶ病毒液ꎬ对照组加入５ｍＬＭＥＭ培养基ꎮ分别于１２ｈ㊁２４ｈ后吸出培养瓶内９０％的液体ꎬ并添加ＧＺＭ至３０ｍＬꎮ每天观察记录死亡数ꎮ１.８㊀无菌斑马鱼转接菌群后浸浴攻毒在１.６的基础上ꎬ４ｄｐｆ时ꎬ更换ＧＺＭꎬ分别接入ＰＢＳ重悬的３月龄斑马鱼肠道菌群(Ｇ组)㊁类志贺邻单胞菌(Ｐｓ组)㊁鲸杆菌(Ｃｅｔｏ组)和维氏气单胞菌(Ａｅｒ组)至水体内菌浓度达到１０６ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ无菌斑马鱼对照组只加入等体积的无菌ＰＢＳ(ＧＦ组)ꎮ菌群和菌株的定量方法详见参考文献[１７ꎬ１８]ꎮ之后将各组斑马鱼转移至２２ħ光照培养箱中过夜ꎮ２４ｈ后吸出瓶内９０％的液体ꎬ添加ＧＺＭ至１０ｍＬꎬ实验组加入５ｍＬＳＶＣＶ病毒液(分别命名为ＧＦ㊁Ｇ㊁Ｐｓ㊁Ｃｅｔｏ㊁Ａｅｒ组)ꎬ对照组加入５ｍＬＭＥＭ培养基(分别命名为ＧＦＣＫ㊁ＧＣＫ㊁ＰｓＣＫ㊁ＣｅｔｏＣＫ㊁ＡｅｒＣＫ组)ꎮ１２ｈ后吸出培养瓶内９０％的液体ꎬ添加ＧＺＭ至３０ｍＬꎮ每天观察记录死亡数ꎮ１.９㊀数据分析所有的统计数据均来自至少３次以上的独立实验ꎬ使用软件ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５.０㊁ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅＥｘｃｅｌ２０１０进行绘图ꎮ数据用 平均值ʃ标准误 (ｍｅａｎʃＳ.Ｅ.Ｍ)的形式进行表示ꎮ采用ｔ￣检验比较不同组数据平均值差异的显著性ꎬＰ<０.０５时认为存在统计学显著性差异ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ标准质粒的构建根据１.５.１ꎬ首先克隆ＳＶＣＶ的Ｇ蛋白基因片段ꎬ大小为１０２ｂｐꎬ使用１.２％琼脂糖凝胶电泳检测(如图１Ａ所示)ꎬ选择阳性结果制作ｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ标准质粒ꎮ随后转化ＤＨ５ɑ感受态细胞扩增ꎬ提取质粒ꎬ使用ＳＶＣＶＧ蛋白引物ＳＶＣＶ￣Ｆ/ＳＶＣＶ￣Ｒ进行ＰＣＲ扩增(同１.５.１)ꎬ产物使用１.２％琼脂糖凝胶电泳检测(如图１Ｂ所示)ꎬ选择阳性结果送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序验证ꎮ结果显示ＳＶＣＶＧ蛋白基因片段已插入ｐＬＢꎬ即成功构建ｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ标准质粒ꎮ２.２㊀ｍｑＲＴ￣ＰＣＲ检测病毒载量以１０倍系列稀释的标准质粒为模板ꎬ选取１０２~１０１０的拷贝数梯度进行ｍｑＲＴ￣ＰＣＲ检测病毒载量ꎮ以重组质粒拷贝数的对数为Ｘ轴㊁Ｃｔ值为Ｙ轴ꎬ构建得到标准曲线ｙ＝－２.９２６４ｘ＋４０.１１２ꎬ相关系数Ｒ２为０.９９７８ꎬ其中１０２和１０１０浓度梯度对应的Ｃｔ值分别为３４.５０和１０.８５ꎮ结果表明构建的荧光定量标准曲线在１０２~１０１０范围内有较好的线性关系(图２)ꎬＲ２值为０.９９７８ꎬ满足实验要求ꎮ图１㊀目的片段电泳鉴定Ｆｉｇ.１㊀Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔ.注:Ａ:ＳＶＣＶＧ蛋白基因片段克隆ꎻＢ:标准质粒中目的片段鉴定ꎮＭ:ＤＮＡ分子标准ꎻＡ中１~２:ＳＶＣＶＧ蛋白基因片段ꎻＢ中１~３:ｐＬＢ￣ＳＶＣＶ￣ＦＲ质粒中的目的片段ꎮ图２㊀ｍｑＲＴ￣ＰＣＲ检测ＳＶＣＶ病毒载量标准曲线Ｆｉｇ.２㊀ＳｔａｎｄｒａｄｃｕｒｖｅｏｆＳＶＣＶｃｏｐｉｅｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ￣ＰＣＲ.使用该体系测定由病毒种子增殖后获取的病毒液中病毒的载量ꎬ检测３个批次ꎬ结果分别为２.６１ˑ１０６ｃｏｐｉｅｓ/μＬ㊁３.６７ˑ１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬ及４.５２ˑ１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ可以满足后续浸浴实验需求ꎮ２.３㊀ＳＶＣＶ浸浴攻毒无菌斑马鱼为了确定浸浴攻毒的条件ꎬ使用５ｍＬＳＶＣＶ病毒液在２２ħ条件下浸浴攻毒５ｄｐｆ无菌斑马鱼ꎬ使水体的病毒浓度达到１０８ｃｏｐｉｅｓ/ｍＬ以上ꎬ分别在浸浴攻毒１２ｈ㊁２４ｈ以后换ＧＺＭꎬ结果如图３所示ꎮ攻毒后５ｄ内ꎬ１２ｈ组和２４ｈ组浸浴２７３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.病毒的无菌斑马鱼幼鱼死亡率没有显著差异ꎬ均在４０％左右ꎬ说明斑马鱼对ＳＶＣＶ也有部分天然的免疫力ꎮ综合考虑ꎬ此后本模型均采用５ｍＬ病毒液浸浴１２ｈ攻毒ꎮ图３㊀ＳＶＣＶ浸浴攻毒无菌斑马鱼幼鱼存活率Ｆｉｇ.３㊀Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｇｅｒｍ￣ｆｒｅｅｚｅｂｒａｆｉｓｈｌａｒｖａｅｅｘｐｏｓｅｄｏｆＳＶＣＶ.２.４㊀ＳＶＣＶ浸浴攻毒转接菌后的无菌斑马鱼使用ＳＶＣＶ病毒液浸浴攻毒无菌斑马鱼(ＧＦ组)㊁转接正常斑马鱼肠道菌群２４ｈ后的无菌斑马鱼(Ｇ组)和同批次的正常斑马鱼(Ｚ组)ꎮ结果显示ꎬ攻毒后５ｄ内ꎬＧＦ㊁Ｇ和Ｚ组死亡率均在６０％左右ꎬ没有显著差异ꎻ各自对照组(ＧＣＫ㊁ＧＦＣＫ和ＺＣＫ)几乎没有死亡(图４Ａ)ꎮ无菌斑马鱼幼鱼分别转接正常成年斑马鱼肠道菌群(Ｇ组)㊁类志贺邻单胞菌(Ｐｓ组)㊁维氏气单胞菌(Ａｅｒ组)及鲸杆菌(Ｃｅｔｏ组)２４ｈ后使用ＳＶＣＶ浸浴攻毒ꎮ结果显示ꎬ攻毒后５ｄ内ꎬＧＦ㊁Ｇ㊁Ｐｓ㊁Ａｅｒ和Ｃｅｔｏ组死亡率均在６０％~８０％ꎬ没有显著差别ꎮ各ＣＫ组几乎没有死亡(图４Ｂ)ꎮ结果表明ꎬ在２４ｈ的菌群转接周期内ꎬ斑马鱼幼鱼的抗病毒免疫未因菌群的定殖而发生显著改变ꎮ３㊀讨论斑马鱼是水产研究领域的模式生物ꎬ受精后发育迅速ꎬ可以进行无菌化处理[１９]ꎬ且可以通过浸浴感染包括ＳＶＣＶ在内的多种病毒[５ꎬ２０ꎬ２１]ꎮ本研究成功构建了无菌斑马鱼的ＳＶＣＶ感染模型ꎬ并结合菌群转接技术ꎬ为系统研究肠道菌群和菌株对病毒感染的影响奠定了基础ꎮ近年来的研究表明ꎬ肠道菌群同生物体抗病毒免疫之间存在着复杂而紧密的关系ꎬ有的对病毒感染起促进作用ꎬ有的则表现出拮抗效应ꎮ在图４㊀ＳＶＣＶ浸浴攻毒斑马鱼幼鱼存活率Ｆｉｇ.４㊀ＳｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｌａｒｖａｅｅｘｐｏｓｅｄｏｆＳＶＣＶ.注:Ａ:ＳＶＣＶ攻毒无菌㊁无菌转接肠道菌群及正常斑马鱼存活率ꎻＢ:ＳＶＣＶ浸浴攻毒转接单菌无菌斑马鱼幼鱼存活率ꎮ哺乳动物的相关研究中ꎬ人类肠道细菌可以促进诺如病毒(ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ)感染人和小鼠的Ｂ细胞[２２]ꎻ而使用抗生素灭杀菌群可以延迟轮状病毒(ｒｏｔａ￣ｖｉｒｕｓ)对小鼠的感染ꎬ并且降低感染率[２３]ꎮ也有研究表明ꎬ经抗生素处理的小鼠对脊髓灰质炎病毒较不敏感ꎬ且病毒在肠道中极少地复制ꎮ暴露于细菌或其含有Ｎ￣乙酰葡糖胺的表面多糖(包括脂多糖和肽聚糖)的脊髓灰质炎病毒感染力增强ꎬ表明抗生素介导的肠道菌群的消耗削弱了肠道病毒感染ꎬ并且肠道病毒利用肠道菌群进行复制和传播[２４]ꎮ在拮抗效应方面ꎬ口服短双岐杆菌增加了小鼠血清中的抗流感病毒ＩｇＧ抗体并且防止了流感病毒感染[２５]ꎻ阴沟肠杆菌(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ)可以抑制无菌猪中诺如病毒的感染性[２６]ꎻ长期服用益生菌可以减少成年人病毒性呼吸道感染的严重程度[２７]ꎻ也有报道显示ꎬ益生菌的使用能降低实验室条件下养殖凡纳滨对虾的白斑综合症病毒感染的死亡率和流行率[２８]ꎮ在建立无菌斑马鱼病毒感染模型的多次试验中ꎬ使用１０８ｃｏｐｉｅｓ/ｍＬ的ＳＶＣＶ浸浴无菌斑马鱼后ꎬ３ｄ内开始出现死亡ꎬ５~６ｄ内达到最大死亡率ꎬ最大死亡率范围稳定在４０％~７０％之间ꎮ尽３７３谢亚东ꎬ等:无菌斑马鱼感染鲤春病毒血症病毒模型的建立. All Rights Reserved.管实验室不同批次无菌鱼存在差异ꎬ但可以认为无菌斑马鱼病毒感染模型已成功建立ꎮ并初步应用本模型探究正常肠道菌群和实验室分离的部分土著菌株对病毒感染的影响ꎬ结果没有呈现明显的正㊁负效应ꎬ推测这可能与菌鱼互作周期有关ꎮ在２４ｈ的转接周期内ꎬ转接斑马鱼肠道菌群和土著菌的无菌斑马鱼与无菌斑马鱼相比ꎬ先天免疫可能没有明显差别ꎬ即短时间的菌群转接可能还不足以对斑马鱼的免疫系统造成明显的差异ꎮ后续将就进一步延长菌鱼互作周期展开相关的研究ꎮ水产领域对于菌群在病毒感染中的作用的研究较少ꎬ对病毒感染也缺乏有效的应对手段ꎬ目前主要通过免疫接种预防ꎮ无菌斑马鱼病毒感染模型的建立ꎬ提供了一个快速筛选与病毒感染相关菌株的途径ꎬ也为进一步探究细菌的抗病毒效应元件提供了可能ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀冯东岳ꎬ温周瑞.鱼类病毒病的研究进展及其展望[Ｊ].养殖与饲料ꎬ２０１１(６):１８－２１.[２]㊀付峰ꎬ刘荭ꎬ黄健ꎬ等.鲤春病毒血症病毒(ＳＶＣＶ)的研究进展[Ｊ].中国水产科学ꎬ２００６ꎬ１３(２):３２８－３３４. [３]㊀ＳａｎｄｅｒｓＧＥꎬＢａｔｔｓＷＮꎬＷｉｎｔｏｎＪＲ.Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆｚｅ￣ｂｒａｆｉｓｈ(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)ｔｏａｍｏｄｅｌｐａｔｈｏｇｅｎꎬｓｐｒｉｎｇｖｉｒｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓ[Ｊ].Ｃｏｍｐａｒ.Ｍｅｄ.ꎬ２００３ꎬ５３(５):５１４－５２１. [４]㊀Ｌóｐｅｚ￣ＭｕñｏｚＡꎬＲｏｃａＦＪꎬＳｅｐｕｌｃｒｅＭＰꎬｅｔａｌ..Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｌａｒｖａｅａｒｅｕｎａｂｌｅｔｏｍｏｕｎｔａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｖｉｒａｌｒｅｓｐｏｎｓｅａｇａｉｎｓｔｗａｔｅｒｂｏｒｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｓｐｒｉｎｇｖｉｒｅｍｉａｏｆｃａｒｐｖｉｒｕｓ[Ｊ].Ｄｅｖ.Ｃｏｍｐ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ２０１０ꎬ３４(５):５４６－５５２. 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[２８]㊀Ｐｅｒａｚａ￣ＧóｍｅｚＶꎬＬｕｎａ￣ＧｏｎｚáｌｅｚＡꎬＣａｍｐａ￣ＣóｒｄｏｖａÁＩꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｂｉｏｔｉｃｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄａｎｔｉｖｉｒａｌｐｌａｎｔｓｒｅｄｕｃｅｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＷＳＳＶｉｎｓｈｒｉｍｐ(Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎ￣ｎａｍｅｉ)ｃｕｌｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ａｑｕａｃ.Ｒｅｓ.ꎬ２００９ꎬ４０(１３):１４８１－１４８９.４７３生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
鱼类细胞培养及其应用_于淼
术。长江水产 研究所和中科院病 毒所通过草鱼肾 脏 合物对细胞色素 P4501A 的诱导能力, 还可以评价样
组织的细胞培 养分离鉴定了 草鱼出血病 病原 ) ) ) 鱼 品的 雌激素活性 , 鱼 类细胞系可 以取代急 性鱼类毒
呼肠病毒, 并 生产了减毒疫苗, 广泛用于生产实 践 中。 1999 年, Zhang 等 [4]人将虹 彩病毒 ( Rana grylio
RTG- 2 细胞研究了虹鳟病毒性出血性败血症( VHS) 病 色大头鲶 BB 细胞系和虹鳟 RTG- 2 细胞系对苯并芘的
毒的特性。1971 年, Fijan[3]等用鲤鱼卵巢原代培养细 反应, 苯并芘可以诱导 CYP1A1 的酶活, 结果表明: 苯
胞分离了鲤鱼春季病毒血症病毒, 而后又从 FHM 细 胞分离出弹状 病毒。Wolf 和 Darlington [3]1971 年 用云 斑叉尾蛔细胞系分离出 CCVD 病毒。1988 年, 童裳亮
水生动物的细胞培养晚于陆生动物, 其中 ( 包括 水生无脊椎动物和水生脊椎动物) , 水生无脊椎动物 的细胞培养主要是甲壳类 ( 如对虾、螯虾、龙虾、蟹和 鲎) 、贝类( 如牡蛎、珍珠贝和蛤) 和海绵的体外培养。 水生无脊椎动物的细胞培养比较困难, 原代培养细胞 不能形成单层, 或即使形成单层, 但细胞不分裂, 难以 进行传代。因而, 至今没有得到水生无脊椎动物的连 续性细胞系。水生无脊椎动物的细胞培养不仅在甲壳 类和贝类的病毒分离、检测和疫苗制备方面有很大的 应用价值, 而且还可能用来生产天然产物比如药物。 已经发现不少海洋无脊椎动物 ( 如海绵、珊瑚、苔藓 虫、海兔和海鞘) 能合成抗癌、抗病毒、抗心血管病的 药物, 若能查明这些药物是在动物的哪些细胞中合成 的, 便可能用细胞培养法来生产。
鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用
比较 容 易 ， 对传 代 培养 时 间 的要 求 弹性 比较 大 ， 温 适
范 围广 ， 使得 鱼类 细胞 系在 生 物 学 研 究 领 域 中得 到
广泛 应用 。 １ ２ 我 国 鱼 类 细 胞 系 建 系 概 况 ．
２ ０株口 。其 中淡 水 鱼 类 和 溯 河 洄 游 性 鱼 类 的 细 ２ 。 胞 系 占大 部 分 ， 水 鱼类 的细胞 系约 占 ３ 左 右 。 海 Ｏ
ｃｔ ｉ） 上 皮 瘤 细 胞 系 Ｅ Ｃ，鲫 鱼 （ａ ａｓｕ ａｐ ｏ Ｐ Ｃ ｒｓ ｓ ｉ ａ ｒ ｔｓ ｕ ａｕ ）鳍细胞 系 Ｃ ＡＲ， 鱼 巨噬 细 胞 系 ＧＭＣ 金 Ｌ， 棕鲴 （ ｉｍｐ ａｅｐ ｏ ｈ ｓ Ｐ ｎ ｈ ｌｓ ｒｍｅ ｚ ）性 腺 细 胞 系 Ｃ Ｏ， Ｃ 大
疾病 防控 具 有一 定的 指 导意 义 。
关 键词 ： 细胞 培 养 ； 毒 学 ； 类 病 鱼
中图 分 类 号 ： ９ １ ￥ ５ ． ５ ￥ ４ ；８ ２ ６ 文献标识码 ： Ｂ 文 章 编 号 ： ０ ７ ５ ３ （ ０ ０ ０ — １ ７０ １ ０ — ０ ８ ２ １ ） ４０ ０ —４
动物 医学 进展 ，０ ０ ３ （ ） １ ７１ ０ ２ １ ，１ ５ ：０ —１
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｃ ｎ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄｉｉ ｅ
弯
若
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瞩专论与讲座
一
鱼 类 细 胞 培 养及 其在 病 毒 学研 究 中的 应 用
李 文峰 ， 康 森 黄 麦 ， 健 史成 银 ，
胚 胎细 胞 系 ＣＨＳ －ｐ 金 头 鲷 （ ｐ ｒ ｓ ｕ ａａ Ｅｓ， Ｓ ａ ｕ ｒ ｔ ）细 ａ
胞 系 Ｓ 一 ， 阳鱼 （ ｅ ｏ ｓ ｃｏｈ ｒ ｓ 鳃 细胞 ＡＦ １ 太 Ｌ ｐ ｍｉ ｍａ ｒｃ ｉｕ ）
海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用
海水鱼类细胞系建立、鉴定及应用摘要:为了预防和控制大规模爆发的鱼类病毒性疾病,海水鱼类细胞系已成为研究病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗的重要体外培养体系。
本文详细总结了海水鱼类细胞系的原代培养步骤、培养体系和细胞系的建立、鉴定的实验步骤,并对海水鱼类细胞系在鱼类病毒学等研究工作中的作用加以综述。
关键词:细胞系海水鱼类鉴定病毒应用引言21世纪是海洋经济的时代,以海水鱼类养殖业为代表的第四次海水养殖浪潮的展开,给中国水产界带来了巨大的经济和社会效益。
但随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀,各种病毒性疾病开始大规模爆发,给鱼类养殖业造成了巨大的经济损失。
为了查清鱼类病毒的感染途径和感染机理,从根本上预防和解决病毒病的传播,鱼类细胞系被广泛应用于鱼类病毒的分离鉴定、病毒病的诊断及病毒与宿主细胞的相互作用机理等研究,成为研究病毒学、细胞毒理学、细胞工程等多种学科的重要体外研究体系[1,2]。
自Wolf和Quimby建立世界上第一株鱼类细胞系——虹鳟鱼生殖腺细胞系[3]以来,鱼类细胞培养与建系研究发展迅速。
尽管淡水鱼类和溯河洄游性鱼类的细胞培养和细胞系建立发展较快,但目前建立并广泛应用的海水鱼类细胞系数量较少,主要来源于牙鲆[4]、大菱鲆[5]、鲈鱼[6]、真鲷[7]、石斑鱼[8-9]等几种经济鱼类,仍迫切需要建立多种细胞系用于多种学科的研究。
因此,本文就海水鱼类细胞系的建立、鉴定方法及其应用展开综述。
1 海水鱼类组织原代培养及细胞系建立的基本方法1.1 原代培养组织来源及培养方法海水鱼类组织原代培养及细胞系建立基本沿用了哺乳动物的细胞培养方法,与淡水鱼类细胞的培养方法也基本类似。
首先选取合适的组织进行原代培养。
根据目前研究显示,海水鱼的各种组织包括分化程度低,分裂潜能大的胚胎和幼鱼组织,以及成鱼性腺、肾脏、心脏、脾脏、鳔、鳍、吻端乃至肿瘤等组织,均可进行原代培养。
从鱼体获取目的组织消毒处理后,一般直接剪成1mm3的组织块于培养瓶中贴壁培养。