致病性菌检测方法-国家标准

大肠杆菌检测方法

一、检测流程图

注：

（1

代表非粪大肠杆菌，没必要在进行下一步鉴定。

（2）典型菌落：深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，具有金属光泽。也有呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。

二、培养基和试剂

1. 双倍乳糖胆盐培养基（货号：022041，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取60 g 到1 L 蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到带有小倒管的试管，115℃高压灭菌20 min 。

2. 伊红美蓝培养基（货号：022060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取37.5 g，加入蒸馏水或去离子水1 L，121℃高压灭菌15 min。

3. 蛋白胨水（货号：022110，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取25 g到1 L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到试管，121℃高压灭菌15 min。

4. 靛基质试剂

柯凡克试剂：5 g对二甲氨基苯甲醛溶于75 ml戊醇，缓慢加入浓盐酸25 ml。

5. 革兰氏染色

1）染液制备

结晶紫染色液，革兰氏碘液，脱色液（95%乙醇），复染液（沙黄复染液/稀石碳酸复红液）2）染色法

A 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。

B 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

C 滴加95%乙醇脱色，约30 s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10 s，水洗。

D 滴加复染液，复燃1 min，水洗，待干，镜检。

3）染色结果

革兰氏阳性呈紫色，革兰氏阴性呈红色。

铜绿假单胞杆菌检测方法一、检测流程图

注：（1

代表非铜绿假单胞杆菌，没必要在进行下一步鉴定。

（2

围培养基常扩散有水溶性色素。

（3）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在滤纸上。滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试剂，在15s-30s之内出现粉红色或紫红色为阳性，阴性不变色。

（4）绿脓菌素试验：取可疑菌落2-3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3-5ml，充分振荡是培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿内，待提取液为蓝色时，将其转移到试管并加入1mol/L盐酸1ml，振荡，静置。上层盐酸出现粉红色到紫红色为阳性。

（5）硝酸盐还原产气试验：取可疑菌落，接种硝酸盐蛋白胨水培养基，37℃培养24h。小倒管有气体为阳性。

（6）明胶液化试验：取可疑菌落，穿刺接种在明胶培养基，37℃培养24h后，放冰箱10-30min，阳性呈溶解状，阴性为凝固不溶。

（7）42℃生长实验：取可疑菌落接种普通培养基，41-42℃培养24-48h，若能生长为阳性，不生长为阴性。

二、培养基和试剂

1. SCDLP液体培养基（货号：027010，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取38 g到1 L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装量90ml，121℃高压灭菌20 min。

2. 十六烷基三甲基溴化铵培养基（货号：027040，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取33.3g到1 L蒸馏水或去离子水，115℃高压灭菌20 min。

3. 绿脓菌素测定用培养基（货号：027050，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取46.4g到1 L蒸馏水或去离子水，再加10g甘油，加热搅拌完全溶解，分装试管，115℃高压灭菌20 min。放置成斜面。

4. 硝酸盐蛋白胨水培养基（货号：027060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取15.5g到1 L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到带有小倒管的试管，115℃高压灭菌20 min。

5. 明胶培养基（货号：022250，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取128g到1 L蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装试管（60-75mm），115℃高压灭菌20 min。垂直放置待其凝固。

6. 营养琼脂培养基（货号：022020，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取33g到1 L蒸馏水或去离子水，121℃高压灭菌15 min。

金黄色葡萄球菌检测方法

注：

（1代表非金黄色葡萄球菌，没必要在进行下一步鉴定。

（2）典型菌落：金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。

（3）甘露醇发酵试验：取可疑菌落，接种甘露醇培养基，液面加2-3mm 灭菌液体石蜡，37℃培养24h ，产酸为阳性。

（4）血浆凝固酶试验：取1：4新鲜血浆0.5ml ，置于灭菌小试管，加入待检菌24h 肉汤培养物0.5ml 。混匀，放37℃培养箱，每半小时观察一次，6h 内出现凝块，则为阳性。同时要做阳性和阴性菌株肉汤培养物对照实验。

二、培养基和试剂

1. SCDLP 液体培养基（货号：027010，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取38 g 到1 L 蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装量90ml ，121℃高压灭菌20 min 。

2. 血琼脂培养基（货号：024060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取40g 到1 L 蒸馏水或去离子水， 121℃高压灭菌15 min 。使用时每100ml 培养基加入无菌脱纤维羊血或兔血5-10ml ，要匀倒平皿。

3. 甘露醇发酵培养基（货号：024030，厂家：广东环凯微生物科技有限公司）

称取30g 到1 L 蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装试管， 115℃高压灭菌20 min 。