第七章重组体克隆的筛选和鉴定总结
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重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
重组体克隆的筛选和鉴定
抗性筛选
通过载体上的抗性基因，如Amp抗性 基因，对重组体克隆进行筛选，重组 的克隆具有抗性。
筛选流程
转化
将目的基因和载体DNA共转化到大肠杆菌中 。
克隆筛选
根据筛选方法，从转化子中筛选出重组体克 隆。
培养和扩增
将筛选出的重组体克隆进行培养和扩增，以 备后续鉴定。
筛选中的注意事项
避免假阳性
在筛选过程中要严格控制条件，避免出现假阳 性结果。
生物化学鉴定法
通过检测表达产物的生化性质， 如酶活性等，判断目的基因是否 成功表达。
鉴定流程
构建重组体克隆
将目的基因与载体DNA连接， 形成重组体克隆。
转化受体细胞
将重组体克隆导入受体细胞中 ，使目的基因在受体细胞中表 达。
筛选阳性克隆
通过抗性筛选、PCR鉴定等方 法筛选出含有目的基因的阳性 克隆。
生物信息学技术
通过生物信息学技术，可以对重组体克隆进行全面的分析和鉴定，包 括基因组、转录组和蛋白质组等多个层面。
重组体克隆在其他领域的应用前景
生物制药
重组体克隆技术在生物制药领域具有广泛的应用前景，可用于生 产高纯度、高质量的药物。
生物能源
利用重组体克隆技术可以改良微生物，提高生物燃料的生产效率。
在生物制药领域的应用
药物靶点发现
01
通过筛选重组体克隆，可以发现新的药物靶点，为新药研发提
供基础。
药物作用机制研究
02
通过鉴定重组体克隆，可以深入了解药物的作用机制，为药物
优化提供依据。
药物筛选
03
利用重组体克隆进行高通量药物筛选，提高药物发现的效率。
在基因治疗领域的应用
基因功能研究
重组体的筛选和鉴定
eflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫 的luciferase 的烟草
GFP- Kac的狗
GFP 老鼠
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、
卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
外源DNA
PstI酶切
黏性末端
pBR322 4363
PstI酶切 黏性末端
连接酶 重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
影印在含Ap的平板上 空载体转化子(amprtetr)
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化
子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用
于筛选植物转化子。
尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生
的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍 有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的 定位分析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）
LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的
转入萤火虫 的luciferase 的烟草
GFP- Kac的狗
GFP 老鼠
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、
卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选 动植物转化子的选择标记基因。
外源DNA
PstI酶切
黏性末端
pBR322 4363
PstI酶切 黏性末端
连接酶 重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
影印在含Ap的平板上 空载体转化子(amprtetr)
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
质4-甲基伞形花酮，以此筛选含GUS基因的转化
子。 由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用
于筛选植物转化子。
尤其是GUS基因的3’端与其他结构基因连接产生
的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍 有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的 定位分析。
⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）
LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
重组子的筛选与鉴定
1.2 -半乳糖苷酶显色反应选择法
1.2.1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的 片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体 菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补 形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能把无 色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴 -4-氯靛蓝。
2.1 Southern blotting
Southern印迹杂交是由E Southern于1975年首先 建立并使用的，故名之。它是根据毛细管作用的 原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结 合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛A 选A过程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
3、PCR扩增检测法
3.1 原理 PCR能在模（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
④漂洗去除游离的没有杂交上的探针分子，经放 射自显影后，便可鉴定出与探针的核昔酸序列同 源的待测DNA片段。据此可以将含有外源DNA片段 的重组子筛选出来。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
2.2菌落印迹原位杂交
是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上， 不必进行核酸分离纯化、内切酶酶解及电泳分离等操作， 而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位 结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有插入 序列的菌落或噬菌斑。由于生长在培养基平极上的菌落 或噬菌斑，是按照其原来的位置不变地转移到滤膜上， 然后在原位发生溶菌、DNA变性和杂交作用，所以菌落 杂交或噬菌斑杂交隶属原位杂交范畴。以菌落原位杂交 为例，操作步骤如下:
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操 作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东 西。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
重组子筛选与鉴定
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
7第七章：真核生物的克隆载体
TRP1和复制起点。
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
16-重组体的筛选和鉴定
高度灵敏性 不影响碱基配对 不影响探针分子的主要理化特性 使用酶促方法时,不影响酶活性 检测方法的灵敏性和特异性高 化学稳定性高 操作的安全性
标记方法
内标记
切口平移法 随机引物法 单链DNA探针 cRNA探针标记
末端标记
切口平移法：dsDNA，掺入率高，最常用
37℃ 15min 限速步骤 37℃ 2～3h
含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后， 建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；
当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。
①筛选植物细胞报告基因（reporter gene)：NPTⅡ, HPT, LUC 报告基因：是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结 构的一部分，具有指示的功能；常与目的基因融合表达，以示 踪目的基因的表达和位置。
•以tk－为受体，载体中加入tk基因， •HAT选择培养基中tk+细胞成活，tk-细胞不能成活 •则阳性重组子可在HAT中成活。
1、快速裂解菌落直接电泳检测法
原理：有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。
方法：从转化后的菌体克隆中分 离质粒，电泳、比较其分子量。
凝胶电泳分离：质粒DNA的电 泳迁移率与其相对分子质量大 小成反比。
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷 类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。
抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。
77
重组质粒DNA携带抗药性基因，转化后受体菌在含有相应抗生 素的培养基上生长，而不含此载体DNA的受体菌不能存活。 88
实验17-重组体筛选与鉴定
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
三 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
Southern blot 筛选 结果
（1）原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
（2）R-环检测法
1）原理： DNA-RNA杂交。
2）选择过程
用外源基因的mRNA与重组载体杂交。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴 30分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
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固相支 待测基因 一抗 持滤膜 产物蛋白
125I标记的二抗
125I 标记的二 固相支 待测基因 一抗 二抗 抗结合蛋白 持滤膜 产物蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法
Southe rn blot 筛选结 果
酶切前
酶切后
载体
插入片断
4. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
第三节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
四、 核酸分子杂交检测法
1、原理： 1）. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2）. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 3）. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P
荧光素
2、菌落噬菌斑原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
3. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探 针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂 交，在底片上曝光显示。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因: Tetr和Ampr。
2Hale Waihona Puke pBR322抗菌素标记选择（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：
重 组 克 载 隆 体
二、限制性酶切图谱法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 酶切这个片断，电泳后比较结果是否符 合预计的结果。
区分重组子与非重组子: 用BamHI酶切转化子质粒 DNA电泳观察酶解产物片段 重组子： 2.7kb+ 4.0kb
三、显色筛选法
载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能 使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选 粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）
第二节 根据重组子的结构特征筛选
利用有插入片段的重组载体分子量比野 生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆 中分离质粒，电泳、 比较其分子量。
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理： 利用一抗（Primary antibody）与目 标分子的特异结合，二抗（secondary antibody）与一抗的特异性结合，二 抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发 光），再通过比色测定有色物质的含 量（或光强度），从而推测目标分子 的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
酶
无色的底物
有色的产物 比色观察
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
（孔底）
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 持滤膜
固相支 抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体 持滤膜 发光，底片曝光
125I标记的
二、免疫沉淀检测法 检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
（3）二抗结合
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、营养缺陷型筛选法 载体上携带有某些营养成分的生物合成基因， 而受体细胞基因突变不能合成生命必须的营 养物质。
如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在 无Leu培养基中不生长， 当 含Leu外源基因在此缺陷菌中 表达时可生长，以此来筛选阳 性克隆。
非重组子： 2.7kb
如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶 将质粒线型化，然后通过其 长度来鉴定其是否为重组子
筛选过程
T A A T
A
A
T T
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法 1. 原理
PCR能在模板上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。