第七章重组体克隆的筛选和鉴定总结

固相支 待测基因 一抗 持滤膜 产物蛋白
125I标记的二抗
125I 标记的二 固相支 待测基因 一抗 二抗 抗结合蛋白 持滤膜 产物蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法
Southe rn blot 筛选结 果
酶切前
酶切后
载体
插入片断
4. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
第三节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 持滤膜
固相支 抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体 持滤膜 发光，底片曝光
125I标记的
二、免疫沉淀检测法 检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
酶
无色的底物
有色的产物 比色观察
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
（孔底）
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
非重组子： 2.7kb
如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶 将质粒线型化，然后通过其 长度来鉴定其是否为重组子
筛选过程
T A A T
A
A
T T
表型筛选加酶切筛选
三、PCR扩增检测法 1. 原理
PCR能在模板上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、营养缺陷型筛选法 载体上携带有某些营养成分的生物合成基因， 而受体细胞基因突变不能合成生命必须的营 养物质。
如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在 无Leu培养基中不生长， 当 含Leu外源基因在此缺陷菌中 表达时可生长，以此来筛选阳 性克隆。
三、显色筛选法
载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能 使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选 粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）
第二节 根据重组子的结构特征筛选
利用有插入片段的重组载体分子量比野 生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆 中分离质粒，电泳、 比较其分子量。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因: Tetr和Ampr。
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。 （3）环丝氨酸：
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理： 利用一抗（Primary antibody）与目 标分子的特异结合，二抗（secondary antibody）与一抗的特异性结合，二 抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发 光），再通过比色测定有色物质的含 量（或光强度），从而推测目标分子 的含量。
四、 核酸分子杂交检测法
1、原理： 1）. 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。
2）. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 3）. 识别标记 （1）放射性同位素 （2）非放射性标记
32P
荧光素
2、菌落噬菌斑原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
3. Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探 针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂 交，在底片上曝光显示。
（3）二抗结合
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
重 组 克 载 隆 体
二、限制性酶切图谱法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 酶切这个片断，电泳后比较结果是否符 合预计的结果。
区分重组子与非重组子: 用BamHI酶切转化子质粒 DNA电泳观察酶解产物片段 重组子： 2.7kb+ 4.0kb
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。