病理组织切片技术

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捞 片
六、贴片、烤片
贴片、烘片
待切片在恒温水面上充分展平后,将蜡 片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上 的余水,置入60~65℃恒温箱内或切 片漂烘温控仪的烘箱内烤片15~30分 钟,脱去溶化组织间隙的石蜡。
烤 片 机
七、染色
染色
定义
用染液对组织切片进行处理,使组 织中的不同成分被染上相应的颜色, 产生不同的折射率,以利于显微镜 观察和分析的方法。
自来水冲洗即可)
② 含乙醇固定液的洗涤方法(用乙醇或乙醇混 合液固定的组织,一般不需要清洗) ③ 特殊固定液的洗涤方法(使用的固定液不同,
洗涤的方法也不一样)
脱水
定义
标本经过固定和冲洗后,组织中含有较多的 水分,必须将组织块内的水分置换出来, 这一过程。
• 无论是用石蜡切片,还是用火棉胶切片, 都必须除去组织中所含水分,因含水组织 与石蜡、火棉胶等包埋材料不相容,常用 的脱水剂为一系列不同浓度的乙醇。
四、浸蜡、包埋
浸蜡
定义
经过透明的组织块在溶化的石蜡中浸渍, 使组织中的透明剂被完全置换出来的 过程
浸蜡的
目的
• 使石蜡浸入组织中,取代组织中含有的透 明剂 。
浸蜡的
种类
• • • • •
石蜡 明胶 火棉胶 树脂 碳蜡
既 是 透 明 剂 ,
又 是 包 埋 剂 。
浸蜡的方法
• 熔点:56~58℃
H.E染色程序如下
• • • • • • • 脱蜡 脱苯
复水
染色
脱水
透明
封固
切片脱水透明要彻底
• HE染色后,要彻底脱水透明,才能进行 树胶封盖,成为永久标本。如果脱水透明 不彻底,封片后呈白色雾状,镜下模糊不 清,过一段时间染片就褪色。脱水要经过 多次无水乙醇,也可使用石炭酸二甲苯进 行脱水。如采用后者,染片要经过多次二 甲苯以除去石炭酸。
常用的透明剂
۩苯 ۩ 甲苯 ۩ 二甲苯(最常用的透明剂) ۩ 三氯甲烷 ۩ 汽油 ۩ 香柏油 ۩ 冬青油 ۩ 松油醇
常用的透明
方法
• 将脱水后的组织块先用乙醇-二甲苯混合液 处理或直接浸入透明剂中,置换透明剂2~3 次即能达到目的。 • 透明的时间的长短取决于标本的种类和组 织块的厚薄,一般活检标本透明15~20min 即可。
固定
目的
¤ 防止自溶和腐败 ¤ 凝固或沉淀细胞内物质 ¤ 硬化组织 ¤ 增加组织的折光率
固定
方法
• (1)小块组织固定法:这是最常用的方法,从人体或动 物体取下的小块组织,须立即置入液态固定剂中进行固定, 通常,标本与固定液的比例为1:4~20,但组织块不宜过 大过厚,否则固定液不能迅速渗透。故取组织块的大小一 般为2.0cm×2.0cm×0.3cm。
及 时 的 进 行 核 对
脱水
目的
组织块经巩固定和水洗后,含有大量水分, 而水与苯、二甲苯等透明剂不混溶,故在组 织前必须用能与透明剂相混合的脱水剂(如 乙醇等),把组织内的水分置出来,为下一步 做准备。
常用的脱水剂
① 乙醇(最常用的脱水剂)
沸点78.4℃,脱水能力强,能硬化组织,可较好地 与二甲苯混合。 脱水的步骤是:80%、90%、95%、100%各种浓 度乙醇2小时,此过程可用脱水机自控完成。 柔嫩组织的脱水应从50%或30%乙醇开始 组织在高浓度乙醇(无水乙醇)中留置时间不宜过 长。
② 丙酮 沸点56℃,可用于染色前后的脱水, 对组织的脱水作用,收缩作用均 比乙醇强,价格较高,一般很少 单纯使用。
• 丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂,但 因其脱水能力很强,对组织有剧烈收缩作 用,在制作科研、教学切片时一般不用该 试剂。因乙醇、丙酮等不溶于石蜡,还要 经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程称为 透明。常用的透明剂有二甲苯、三氯甲烷、 水杨酸甲酯等
包埋机
组 织 包 埋 盒
四、切片
常用的切片方法
① 石蜡切片 ② 冰冻切片 ③ 火棉胶切片
切片前准备
(1)修整蜡块
可视其组织的大小, 在组织边缘约0.1~ 0.2cm处,切去余蜡部 分。
否则易造成组织皱缩不 平。
(2)准备好切片用具
切片刀 毛笔 眼科镊子(弯) 漂烘温控仪
(3)安装蜡块
③ 异丙醇 是乙醇的良好的代用品,不含水, 可代替无水乙醇。
脱水的方法
自低到高溶度依次进行,使组织中 所含水分逐渐减少直至被脱水剂代 替。
脱 水 机
透明
定义
用某些化学试剂将组 织中的脱水剂置换 出来,以利于浸蜡 和包埋,因组织块 浸入这此试剂后常 呈半透明状
透明
目的
Ö透明是制片过程中很重要的环节。大 多数脱水剂不能和包埋剂(如石蜡) 混溶,而透明剂即可与脱水剂混溶, 又能和包埋剂(如石蜡)混溶,能起 到桥梁作用。
90ml,40%甲醛10ml配制而成 ④ Bouin液 ⑤ Zenker液
红色字体为常用固定液
固定的注意事项
♦ ♦ ♦ ♦ ♦ 及时固定(夏天超过4h,冬天超过24h组织会干涸、自溶、腐败。) 固定容器宜大 固定液应足量(为被固定组织体积的10~20倍) 防止组织变形 确定恰当的固定时间(12~24h)
固定不充分
固定充分
三、洗涤、脱水、透明
洗涤
定义
用水或乙醇等组织经过固定处理后, 未与组织结合的固定液及沉淀物清洗掉 的过程。
洗涤
目的
去掉未与组织结合的固定液及沉淀物 避免组织中留有较多的固定液而妨碍 脱水 组织中生成的沉淀物或结晶而影响染 色和观察 可减少甲醛色素
洗涤的方法
① 含水固定液的洗涤方法(常用的是甲醛,用
常用的染色方法
苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin)染色法 简称H.E染色法。 这种方法对任何固定液固定的组织和应用各 种包埋法的切片均可使用。
• 苏木素是一种碱性染料,可使组织中的嗜碱 性物质染成蓝色,如细胞核中的染色质等; 伊红是一种酸性染料,可使组织中的嗜酸 性物质染成红色,如多数细胞的胞质、核 仁等在H.E染色的切片中均呈红色。
浸蜡机
包埋
定义
• 将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中, 石蜡凝固后,组织即被包在其中称蜡块, 此过程称为包埋。
♥ ♥ ♥
可 使 组 织 具 有 一 定 硬 度 和 韧 性 有 利 于 切 成 薄 片
包 埋 的
目 的
有 利 于 组 织 块 的 妥 善 保 存
包埋方法
• • • •
石蜡包埋法(最常用) 火棉胶包埋法 碳蜡包埋法 明胶包埋法

按照病理检查的目的和要求,切取适 当大小和数量的组织块,用于制作组织切 片的过程。
切 片 刀
取材
要求
(
1)材料新鲜:取材组织愈新鲜愈好,人体组织一般在离体
后,动物组织在处死后迅速固定,以保证原有的形态学结 构。
(2)组织块的大小:所取组织块较理想的体积为
2.0cm×2.0cm×0.3cm,以使固定液能迅速而均匀地渗入 组织内部,但根据制片材料和目的不同,组织块的较理想 体积也不同,如制作病理外检、科研切片,其组织块可以 薄取0.1~0.2cm即可,这样可以缩短固定脱水透明的时间, 若制作教学切片厚取0.3 ~0.5cm,这样可以同一蜡块制 作出较多的教学切片。
固 定 液
红色字体为常用固定液
混合固定液
① 中性甲醇液: 甲醛120ml,蒸馏水880ml,磷
酸二氢钠4g,磷酸氢二钠13g配制而成,PH值 达到7。此固定液是人体组织和动物组织常用之 固定液,特别是作免疫组织化学染色固定时效果 较好。
② 乙醇-醋酸-甲醇液 ③ 乙醇-甲醇液(AF液): 95%或无水乙醇
常用固定液
特性
渗透力强,能迅速渗入组织内部 不会使组织过度收缩或膨胀 能硬化、固定组织,使细胞成分的形态和位置与 生活状态时相似。 使组织对染料产生较强的亲和力,并产生较佳的 折光率。
常用的固定液
单纯固定液
① 10%甲醛(福尔马林):甲醛浓度为40%,指10ml甲醛加入90ml的水配成的。 ② 乙醇(80%~90%最好) 乙酸(醋酸、冰醋酸)
固 定 液
组织固定的常见问题
固定液使用时间较长,有效浓度降低 固定时间正常, 但固定时间效果差 固定液的量不足
标本过薄 标本扭曲变形,过脆过硬 固定液浓度过高,过程过强 固定时间长 标本之间重叠或与容器壁、底部紧Leabharlann Baidu 标本局部固定不良 标本过多,容器太少 标本轻,漂浮于固定液面
标本过大,过厚 标本中心固定不透 固定液渗透力强,浓度高使组织表层迅速硬化 固定时间短 固定液失效
(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等,
可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后,或多或少会产生收缩现
象,有时甚至完全变形。为此可将组织展平,以尽可能维持原形。
二、固定
定义
将组织浸入某些化学试剂。使组织细胞内所含 物质尽量保持在生活状态时形态结构和位置的过 程。
包埋的注意事项
包埋时,框要比组织块大,保证蜡块 组织周围都有蜡边,对管、腔、壁组织要 垂直包埋,而胃、肠、胆囊等组织,应将 能看到的组织学各层面作为切面,其他组 织则将切面朝下,小块多颗组织尽量放在 一起并保持在同一水平面;包埋的蜡质不 能含有杂质、纸絮、缝线等异物,最好是 经过多次溶化、沉淀过的蜡。以利于切片。
④ 蜡片厚度一般在3-5um ⑤ 同一把切片刀每次要固定角度 ⑥ 切片有纵纹,可能与切片刀有小缺 口或修块时未把杂物去除,以及石 蜡不洁有关
切 片 机
五、展片
展片
定义 连续转动旋转轮,切片的蜡片相连成状,需 要将其展平整才能贴在载玻片上,此过程 为展片。
展片
捞片
展片困难时,可先将蜡带放入30%乙醇处展, 在用载玻片捞起蜡带放入温水中。待蜡带 中的组织完全展平后,即可将其捞出,称 为捞片。
将修好的蜡块安装在金属或木制持蜡器上
(4)安装切片刀
将切片刀安装在切片机的刀台上,把 刀台上的紧固螺丝旋紧,使切片时不 产生振动,能保持一定的切片厚度
组 织 切 片 刀
(5)切片的厚度
切片机的厚度调节器上刻有0~50μm 或0~25μm,可任意选择其厚度,石 蜡切片的厚度一般在4~6μm
• 温度:58~60℃(高于石蜡熔点2~3℃)
浸蜡的
注意事项
首先,应保证所用石蜡的质量,尽量不含杂质,否则易造 成切片刀刀口受损或切片破碎、划痕增多。 其次,浸蜡用的石蜡熔点应控制在55~58℃。蜡温过低, 浸蜡不良;蜡温过高回烫伤组织,是组织收缩、变硬、切 片时易脱片、卷片。 再次,要控制好浸蜡时间。时间过短,蜡没有完全渗入组 织、组织过软;时间过长,造成组织硬脆。两者均可造成 切片困难。另外,应尽量去除沾在组织上的二甲苯,在浸 蜡。
注意
• 切片在染色前必须脱蜡干净:未完全脱蜡 的组织切片,染色后组织和细胞模糊不清。 脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯,时 间为10~20分钟,应视所用二甲苯的新旧以 及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些,不 应过短
(3)勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪
要锋利,切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧,以免 因挤压而使组织、细胞变形。
4)规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材,病理标本取
材按照各病变部位、性质的不同,根据要求规范化取材。
(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构,决定其切面的走向。
纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键,如长管状器官以横切为 好。
组织制片技术
病理组织制片技术
定义 • 要实现对病变组织的显微镜形 态学检查,需要将获得的病变 组织制片。我们将切片制作所 采用的一系列技术。
组 织 制 作 基 础 制 作 流 程
• • • • • • • • • • • • • 取固洗脱透浸包切展贴烤染封 材定涤水明蜡埋片片片片色片
一、取材
定义
切片制作过程
1. 将切片刀安装于刀架上(调整好刀的角度, 一般为20~30°左右) 2. 将蜡块固定在切片组织块夹具上 3. 调整组织块夹具的调节蜡旋,使蜡块切面 与刀口平行。
4. 先粗修( 30~50um ) 5. 细修( 10um )
切片的注意事项
① 切片前蜡块要冷冻,但不能把刚包埋 好的热蜡块冷冻,否则蜡块会产生裂 痕,一夹就碎。 ② 蜡块装机时,应注意组织包埋的方向, 组织的层次、纤维、肌肉等走向应与 切片刀平行。 ③ 蜡块在切片机固定加紧后要修块,组 织块上下留边各2mm
• (2)注射、灌注固定法:某些组织块由于体积过大或固 定液极难渗入内部,或需要对整个脏器或整个动物体进行 固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入 血管,经血管分支到达整个组织和全身,从而得到充分的 固定。
• (3)蒸汽固定法:比较小而厚的标本,可采用锇酸或甲醛 蒸汽固定法。如血液涂片,则应在血片未干燥前采用锇酸 或甲醛蒸汽接触固定。
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