质粒转化大肠杆菌实验

4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等， 倒置放入培养箱。
5．感受态大肠杆菌的制备： （1）在无污染的条件下，用 LB 扩增大肠杆菌，并离心 收集。 （2）4℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl2 重悬沉淀，再离 心沉淀，以洗去 LB 培养液。 （3）4℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl2 重悬沉淀，分装 备用。大约 50ml 的 LB 培养液的大肠杆菌，溶于 2ml 的 CaCl2 中（每 ml LB 培养液大约含 108 成活的大肠杆菌，LB 培养的 菌落要求划皿约 16-20 小时的菌落）。
2．为扩增质粒和其它载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需 要 20-30 分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到 几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可 以在短时内极大地扩增目的质粒。 * 作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过 的工程菌。
原理
本实验通过 CaCl2 对特定的大肠杆菌处理，制备感受 态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒 DNA，如一些 插入目的 DNA 片段的重组质粒，产生 5×106-2×107 个转 化的菌落。
6．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不使用玻 璃器皿，以免降低转化效率；
7．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高转化效 率；
8．在整个实验过程中，要注意冰上操作。
2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂 板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通 实验台上操作。
3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后 方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议 采用成 L 型的自制玻璃涂棒，这样由于 L 型的下端与琼脂板 的接触面大，不易将琼脂板划破。
实验 2
质粒转化大肠杆菌
目的
1．重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的 重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把 重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗 性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环 化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗 相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传 代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素 而死亡。
实验准备
（参考教材）
实验步骤
自-70℃冰箱中取出感受态大肠杆菌，插入湿冰中溶
解约 5 分钟，轻轻混匀。吸取 50ul 移入 1.5ml 管，并立刻
将细菌放回-70℃冰箱。
细菌
50 ul
DNA
5 ul
轻轻混匀，静置冰上 30 分钟。
于 42℃水浴中热休克细菌 90 秒，迅速移入湿冰中，
静置 2 分钟，加入 900ul LB 培养液，放入 37℃恒温箱摇
4. 出现菌落，符 合要求。
结果分析及处理办法ห้องสมุดไป่ตู้
1、有菌落，说明转化成功，但有两种可能性 。其一，质粒自身环化；其二，重组成功。 2、无菌落，说明实验1，2中，至少有一个实 验没有成功。 3、菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够 或失效。 4、出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。
注意事项
1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而 采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环 素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。
当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆 菌的表面，在 42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质 粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随 后，加入 LB 培养液，于 37℃振动培养可使细菌复苏，并 且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化 成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌 落。
床，225rpm 摇晃培养 1 小时。取 100ul 涂于含氨卞青霉素
的 LB 琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于 37℃的培
养箱中过夜。
次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
1. 无菌落，失败。 或培养条件不充 分。
2. 菌落布满如苔 样，失败，可能 是抗生素浓度不 够或失效。
3. 菌落布满，浓 度太高，失败。