葡萄糖酸发酵生产
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葡萄糖酸发酵生产ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
葡萄糖酸发酵的生物工艺
• 黑曲霉发酵能力的特性不仅由其遗传 特性决定，其所处的环境条件也决定 了发酵法生产葡萄糖酸的产量，发酵 法生产葡萄糖酸产量的高低除了受生 产菌种的影响外，培养基的组成和培 养条件对产量的影响也很大。黑曲霉 发酵水平的提高，主要依赖于菌种选 育及发酵工艺(培养基和培养条件)的优 化，这两个环节是相辅相成的。
• 葡萄糖酸钠可分为工 业级，食品级和医药 级目前我国市场价格 分别在4300-4800 /t，
葡萄糖酸发酵78生88产0000--810500000元元／／t，t。
山东凯翔生物化工有限公司专业从事葡萄糖 酸钠，葡萄糖酸内酯，衣康酸的研究、开 发、生产和销售，拥有先进的生物发酵设 备、一流的检测手段、现代化的科学管理 级雄厚的技术力量，并通过了ISO9001国 际质量管理体系认证、ISO14001国际环境 管理体系认证、OHSAS18001国际职业健 康安全管理体系认证。
葡萄糖酸发酵生产
菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传 和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异， 再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水 平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基 的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅 拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的 生物合成的全过程，提高发酵产量。通过工 艺优化，改进发酵培养基成份和发酵条件， 创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件， 充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发 酵产量
葡萄糖酸发酵生产
蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖 氧化酶将培养基中 的葡萄糖转化为葡萄 糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I- 离子还原 为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反 应形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝 色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的 产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖 氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大 提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种效 率。
公司年产葡萄糖酸钠35000吨，是国内 最大的生产供应商，生产的“凯翔”牌葡 萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯各项技术指标均 达到国际先进水平，产品畅销美洲、欧洲、 东南亚、中东等国葡萄糖家酸发和酵生地产 区。
上海卡博工贸有限公司 山东新华医药集团 山东中舜科技发展有限公司
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖酸的发现
• 1880年Boutroux发现使 用醋化醋杆菌发酵葡萄糖 能够产生一种不挥发的酸， 后来确定为葡萄糖酸。 以后的许多研究者报道了 其他几种细菌也能够产生 葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。 上个世纪30年代以前，生 产葡萄糖酸主要是使用细 菌。1922年，Molliard发 现，利用霉菌也能够发酵 葡萄糖酸，后来人们知道 黑曲霉、米曲霉、文民曲 霉和青霉都有氧化葡萄糖
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育
黑曲霉P-9 经过紫外线照射处理，共获 得8 个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌 株，分别是U-15、U-17 、U-56、U69、U-78。5个耐2- 脱氧-D- 葡萄糖 突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个 菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株， 产酶水平最高的是U-69 菌株，为是 28.7U/g出发菌株P-9倍，结果见表1。
葡萄糖酸的发酵生产
生工本0901 寇凤雨
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖酸的性质
• 葡萄糖酸是葡萄糖 衍生的糖酸,分子式 为C6H12O7。为结 晶状化合物，熔点 131℃,呈弱酸性， 溶于水，微溶于乙 醇。在水溶液中转 化为γ-葡萄糖酸内 酯和 δ－葡萄糖酸 内酯的平衡混合物。
葡萄糖酸发酵生产
• 葡萄糖酸作为蓬松剂、 凝固剂、鳌合剂、酸 味剂而广泛应用于食 品、医药、建筑等行 业，葡萄糖酸与钠、 钙、锌、亚铁等金属 氧化物合成制得的葡 萄糖酸盐可作为食品 添加剂和营养增补剂 添加到食品中。葡萄 糖酸的金属络合物在 碱性体系中广泛用作 金属离子的掩蔽剂。
的菌株，分别进行发酵并测定葡萄糖氧化
酶活力。
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖氧化酶酶活力的测定
本研究采用分光光度计分析法测定葡萄 糖氧化酶活性。反应混合液含 2mL1mol/L 葡萄糖（0.1mol/L的柠檬 酸钠-磷酸缓冲液配制，PH=5.0)， 1mL 0.1％苯醌和100uL 粗酶液，反应 液于35 ℃下保温反应10min，于 290nm 处测定形成的氢醌的量。葡萄 糖氧化酶的单位（U）定义为35 ℃ PH=5.0 下每克菌体每分钟产生1umol 氢醌的酶量。
葡萄糖酸发酵生产产 生葡萄糖酸的能力。
葡糖糖酸工艺的发展
• Bernhager在1924 年发现，采用中和 生成酸的方法，黑 曲霉能够高效地将 葡萄糖转化为葡萄 糖酸，而添加碳酸 钙是最好的。在较 低温度，限制氮源 的条件下，生成的 葡萄糖酸几乎可以 达到理论产率。
葡萄糖酸发酵生产
1952年，Blom等发明了添加NaOH、维持 pH6．5以上的方法生产葡萄糖酸钠，使糖的 转化率达95％以上，发酵时间缩短至20小时 以内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基 础。
葡萄糖酸发酵生产
• 1999 年,黄道震等以葡萄糖含量为30 %的 发酵培养基接种10 %的黑曲霉种子液,通气、 220 r ·min - 1，搅拌、流加氢氧化钠溶液 控制p H 值6.0～6.5 、温度32～ 34 ℃、 发酵20 h , 残糖可降至1 g ·L - 1 以下。
• 2002 年,Anastassiadis 等利用筛选得到 的短梗霉( Aureobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进行了静息细 胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实验, 葡萄糖酸浓度可达260 g ·L - 1 ,最高生成速 率为19 g·L - 1.h - 1 。
葡萄糖酸发酵生产
高产菌株的筛选
紫外线诱变取黑曲霉P-9的孢子，用无菌生 理盐水制成108个/mL的孢子悬液。取 2mL孢子悬液于无菌培养皿中，铺成一层 薄层，于暗室内30w紫外灯下20cm处照射 8min。取照射液进行适当稀释，涂布于选 择培养基，用黑纸包裹，30℃恒温避光培 养4d，待长出孢子后，将孢子点种于筛选 培养基，挑选在菌落周围出现较大蓝色圈
葡萄糖酸发酵的生物工艺
• 黑曲霉发酵能力的特性不仅由其遗传 特性决定，其所处的环境条件也决定 了发酵法生产葡萄糖酸的产量，发酵 法生产葡萄糖酸产量的高低除了受生 产菌种的影响外，培养基的组成和培 养条件对产量的影响也很大。黑曲霉 发酵水平的提高，主要依赖于菌种选 育及发酵工艺(培养基和培养条件)的优 化，这两个环节是相辅相成的。
• 葡萄糖酸钠可分为工 业级，食品级和医药 级目前我国市场价格 分别在4300-4800 /t，
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山东凯翔生物化工有限公司专业从事葡萄糖 酸钠，葡萄糖酸内酯，衣康酸的研究、开 发、生产和销售，拥有先进的生物发酵设 备、一流的检测手段、现代化的科学管理 级雄厚的技术力量，并通过了ISO9001国 际质量管理体系认证、ISO14001国际环境 管理体系认证、OHSAS18001国际职业健 康安全管理体系认证。
葡萄糖酸发酵生产
菌种选育按照生产要求，根据微生物的遗传 和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异， 再经过筛选获得高产变株而达到提高发酵水 平的目的；而发酵工艺的优化是改变培养基 的在发酵过程中改变培养温度、通气量、搅 拌转速、调节pH等措施，从而强化微生物的 生物合成的全过程，提高发酵产量。通过工 艺优化，改进发酵培养基成份和发酵条件， 创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件， 充分发挥菌种的生产潜力，从而显著提高发 酵产量
葡萄糖酸发酵生产
蓝圈法的原理是微生物产生的葡萄糖 氧化酶将培养基中 的葡萄糖转化为葡萄 糖酸，葡萄糖酸与KI反应将I- 离子还原 为I元素，I与培养基中的可溶性淀粉反 应形成蓝色化合物而使菌落周围出现蓝 色圈，蓝色圈的大小与葡萄糖氧化酶的 产量成正相关。该方法可以作为葡萄糖 氧化酶产生菌的高通量筛选方法，大大 提高葡萄糖氧化酶产生菌的诱变育种效 率。
公司年产葡萄糖酸钠35000吨，是国内 最大的生产供应商，生产的“凯翔”牌葡 萄糖酸钠，葡萄糖酸内酯各项技术指标均 达到国际先进水平，产品畅销美洲、欧洲、 东南亚、中东等国葡萄糖家酸发和酵生地产 区。
上海卡博工贸有限公司 山东新华医药集团 山东中舜科技发展有限公司
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葡萄糖酸的发现
• 1880年Boutroux发现使 用醋化醋杆菌发酵葡萄糖 能够产生一种不挥发的酸， 后来确定为葡萄糖酸。 以后的许多研究者报道了 其他几种细菌也能够产生 葡萄糖酸和酮基葡萄糖酸。 上个世纪30年代以前，生 产葡萄糖酸主要是使用细 菌。1922年，Molliard发 现，利用霉菌也能够发酵 葡萄糖酸，后来人们知道 黑曲霉、米曲霉、文民曲 霉和青霉都有氧化葡萄糖
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖氧化酶产生菌的诱变选育
黑曲霉P-9 经过紫外线照射处理，共获 得8 个耐受2-脱氧-D-葡萄糖的突变菌 株，分别是U-15、U-17 、U-56、U69、U-78。5个耐2- 脱氧-D- 葡萄糖 突变株经蓝圈筛选和发酵测定，有3个 菌株的葡萄糖氧化酶产量高于出发菌株， 产酶水平最高的是U-69 菌株，为是 28.7U/g出发菌株P-9倍，结果见表1。
葡萄糖酸的发酵生产
生工本0901 寇凤雨
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖酸的性质
• 葡萄糖酸是葡萄糖 衍生的糖酸,分子式 为C6H12O7。为结 晶状化合物，熔点 131℃,呈弱酸性， 溶于水，微溶于乙 醇。在水溶液中转 化为γ-葡萄糖酸内 酯和 δ－葡萄糖酸 内酯的平衡混合物。
葡萄糖酸发酵生产
• 葡萄糖酸作为蓬松剂、 凝固剂、鳌合剂、酸 味剂而广泛应用于食 品、医药、建筑等行 业，葡萄糖酸与钠、 钙、锌、亚铁等金属 氧化物合成制得的葡 萄糖酸盐可作为食品 添加剂和营养增补剂 添加到食品中。葡萄 糖酸的金属络合物在 碱性体系中广泛用作 金属离子的掩蔽剂。
的菌株，分别进行发酵并测定葡萄糖氧化
酶活力。
葡萄糖酸发酵生产
葡萄糖氧化酶酶活力的测定
本研究采用分光光度计分析法测定葡萄 糖氧化酶活性。反应混合液含 2mL1mol/L 葡萄糖（0.1mol/L的柠檬 酸钠-磷酸缓冲液配制，PH=5.0)， 1mL 0.1％苯醌和100uL 粗酶液，反应 液于35 ℃下保温反应10min，于 290nm 处测定形成的氢醌的量。葡萄 糖氧化酶的单位（U）定义为35 ℃ PH=5.0 下每克菌体每分钟产生1umol 氢醌的酶量。
葡萄糖酸发酵生产产 生葡萄糖酸的能力。
葡糖糖酸工艺的发展
• Bernhager在1924 年发现，采用中和 生成酸的方法，黑 曲霉能够高效地将 葡萄糖转化为葡萄 糖酸，而添加碳酸 钙是最好的。在较 低温度，限制氮源 的条件下，生成的 葡萄糖酸几乎可以 达到理论产率。
葡萄糖酸发酵生产
1952年，Blom等发明了添加NaOH、维持 pH6．5以上的方法生产葡萄糖酸钠，使糖的 转化率达95％以上，发酵时间缩短至20小时 以内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基 础。
葡萄糖酸发酵生产
• 1999 年,黄道震等以葡萄糖含量为30 %的 发酵培养基接种10 %的黑曲霉种子液,通气、 220 r ·min - 1，搅拌、流加氢氧化钠溶液 控制p H 值6.0～6.5 、温度32～ 34 ℃、 发酵20 h , 残糖可降至1 g ·L - 1 以下。
• 2002 年,Anastassiadis 等利用筛选得到 的短梗霉( Aureobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进行了静息细 胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实验, 葡萄糖酸浓度可达260 g ·L - 1 ,最高生成速 率为19 g·L - 1.h - 1 。
葡萄糖酸发酵生产
高产菌株的筛选
紫外线诱变取黑曲霉P-9的孢子，用无菌生 理盐水制成108个/mL的孢子悬液。取 2mL孢子悬液于无菌培养皿中，铺成一层 薄层，于暗室内30w紫外灯下20cm处照射 8min。取照射液进行适当稀释，涂布于选 择培养基，用黑纸包裹，30℃恒温避光培 养4d，待长出孢子后，将孢子点种于筛选 培养基，挑选在菌落周围出现较大蓝色圈