最新北大医学部复习资料(精品)CRISPR-cas9基因敲除原理及其应用
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CRISPR-cas9基因敲除原理及其应用
什么是CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9基因编辑技术？其原理和技术要点是什么？与RNAi的区别在于何处？举一个应用的例子？
答：定义：CRISPR/Cas9是最新出现的一种由人工构建RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。
原理：在CRISPR/Cas9系统中，CRISPR转录后形成crRNA，crRNA通过碱基配对与tracrRNA 结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA），Cas9首先与sgRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
技术要点：1. 从已知序列中通过PAM定位寻找合适的靶点并合成gRNA；
2. 构建gRNA与Cas9重组质粒；
3. 对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算；
4. 挑选活性较高的敲除质粒导入细胞或体内进行基因组定点编辑操作；
5. 利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果。
区别：CRISPR/Cas9与RNAi的区别如下表：
应用：Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。