4-无菌及微生物检查方法验证

真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼
可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至 千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单 细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多 细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。
药品污染常见的真菌
毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 一、毛霉属（Mucor Micheli ex Fries） 毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并 引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。
阳性对照 根据供试品特性选择阳性对照菌： 无抑菌作用及抗革兰阳性菌 抗革兰阴性菌 抗厌氧菌 抗真菌 加菌量 结果判断
阴性对照
供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释 液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴 性对照不得有菌生长。
无菌检查法
包括薄膜过滤法和直接接种法。 只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
制备好的培养基应在2-25℃、避光保存； 保存在非密容器中，应在3周内使用；保 存在密闭容器中，可在1年内使用。
培养基的适用性检查
无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌 生长。试验可与无菌试验同时进行。
灵敏度检查
百度文库
菌种 菌液制备 黑曲霉菌液的制备 培养基接种 参照中国药典2010版
试验菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠 菌、黑曲霉、枯草杆菌。
菌液制备 同计数培养基的适用性检查。
（1）试验组 ① 平皿法 ②薄膜过滤法
（ 2）菌液组 （3）供试品对照组 （4）稀释剂对照组
结果判断
在3次独立的平行试验中 ⑴稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于 70%。 ⑵试验组的菌数回收率均不低于70%。 ⑶若试验组的菌数回收率低于70%，应 采用其他方法或使用联合方法消除供试品 的抑菌活性，并重新进行方法验证。
薄膜过滤法
过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般 薄膜过滤器。 选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。
⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂 供试品。
⒉水溶性供试品直接过滤。
⒊可溶性固体制剂供试品。
⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医 疗器具的供试品。
直接接种法
供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养 基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养 基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体 积的10%。同时硫乙 醇酸盐培养基不得少于 15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基 用量和高度应经方法验证。
作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的 可靠性，实现一次检出的要求。 ⒉是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来 的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境 的洁净度须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。
培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 0.5%葡萄糖肉汤培养基
菌种的管理
1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的 条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人 员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有 较强的责任心。
2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序 管理制度；
包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、 传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验 以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准 菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代， 鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种 保存的位置和条件及其它需要的程序。
根霉属（RhizopusEhrenberg）
根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食 品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。
曲霉属（Aspergillus）
曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚 有色物质，为有隔的多细胞。本属的 常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的 致癌性。
青霉属
菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出， 无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一 级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。 本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种 神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；
⑷ 重新验证
药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验 条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所 发生的变化不影响该药品中的微生物检查。
验证试验用菌株的要求
⑴验证试验用菌株应有代表性。 ⑵试验菌株应选择非致病性菌株。 ⑶试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。 ⑷菌株传代次数不得超过第五代。
试验用菌株的储藏
⒈我国无菌和微生物检验方法验证的概况 ⒉国外无菌和微生物检验方法验证的概况 ⒊国外无菌和微生物检验方法验证的概况
药品微生物检验方法验证的基本要求
验证试验的设计需综合全面考虑，主要有 以下几方面；
⑴供试品特性
⑵检验目的 ⑶试验全方面验证
当验证试验符合要求时，就可认为在该试验 条件下该供试品对微生物无抑菌作用或抑菌 作用可忽略不计，供试品检验结果可真实的 体现。
霉菌菌落形态
霉菌在孟加拉红培养基上的形态
酵母菌显微镜下形态
无菌检查法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一 种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表 明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
试验环境 检验依据
无菌保障
隔离系统的应用
应用隔离系统重要的目的 ⒈是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操
结果判断
空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长 良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 试验同时应做空白对照
稀释液、冲洗液
0.1%蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜 的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭 菌后加入表面活性剂或中和剂等。
3 、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱 不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有 专用的冰箱，应上锁管理。 4、由专人按操作规程和有关要求定期进行传代， 并定期对保存的菌种进行检查，一般每年 1～2次，（或定期更换冻干菌种）。 4 、发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现 菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。 尤其长期保存时。 并详细记录
无菌检查及微生物检查方法验证
介绍内容
一、微生物的基础知识 二、无菌检查方法 三、无菌检查及微生物检查方法验证
微生物基础知识
微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原 体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放线菌）等。
菌种及菌液制备
参照《中国药典》2010版附录无菌检查法方法验证 菌悬液的制备与保存。
验证方法
薄膜过滤法 ⑴过滤 ⑵接种培养基 ⑶对照试验 ⑷培养
直接接种法、 结果判断、 处理方法 参照《中国药典》2010版附录无菌检查法方法。
微生物限度检查方法验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
目的： 增加试验方法的完整性、保证检验结果的可 靠性。
何时验证：建立供试品的微生物限度检查法时；供 试品的组分或原检验条件发生改变可能影响 检验结果时 。
验证方法
菌液制备 50～100cfu/ml。 验证方法 试验组、菌液组、供试品对照组、
稀释剂对照组。 结果判断 供试品组、对照组、稀释剂对照组
的菌回收率均不低70% 。
验证方法
⑴按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所 规定的方法及下列要求进行。 ⑵对各试验菌的回收率应逐一进行验证。 ⑶验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并 分别计算各试验菌每次试验的回收率。
⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体形态。 ⑶选择最适宜的方法保藏。 ⑷定期对保藏的菌种进行检查。
菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5 代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代） 防止过度的传代造成菌种变异。 1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中， 任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。 必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进 行确认。
标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可将
培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装 于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存， 超低温冷冻(低于-70℃)等方法保存。
冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新 冷冻或再次使用。
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍 生物仅可用作工作菌株。
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜 的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：
无菌检查法方法验证
目 的：以证明所采用的方法适合于该产品的无 菌检查，保证检验结果的可靠性． 何时验证：当建立产品的无菌检查法时，应进 行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该 产品的无菌检查。 若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查 方法应重新验证。
验证方法
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下 列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行 验证。
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其 特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式 繁殖。
细菌的形态
⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观 察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百 倍至上千倍才能观察。
⒉一般以微米（µm）作为测量单位。 ⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌
药品无菌检查和微生物检查方法验证
方法验证的必要性 ⒈为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确
的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对 选择的方法进行验证。 ⒉证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方 法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。
检验结果的影响因素
⒈供试品的组分 ⒉环境影响 ⒊检验方法 ⒋检验条件
⑴ 对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控 结果不符合无菌检查法的要求。
⑵ 回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染 的因素；
⑶ 阴性对照管有菌生长。
⑷ 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物 生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌 操作技术不当引起的。
⑸试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同 量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符 合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。
制备培养基的要求
⒈培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结 束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度 1/2。 ⒉培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5， 否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。 ⒊配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
培养基的贮存
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造 的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细 胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不 至于死亡，以减低菌种的变异率。
标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供 的说明或按验证的方法进行。
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以
抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干 燥和真空是菌种保藏的重要手段。
菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应 有证明和登记，并包装严密。
菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有 详细记录。
菌悬液的制备与保存
参照《中国药典》2010版附录菌悬液的制 备与保存。
供试品抑菌活性的处理
对含抑菌活性的供试品在进行微生物检查前，应 对抑菌活性进行处理，验证试验可根据供试品的 物理或化学特性选择下述方法来消除抑菌活性； ⒈培养基稀释法 ⒉中和法 ⒊薄膜过滤法 ⒋离心沉淀法
培养及观察
培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外 观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至 同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天， 观察有无菌生长或镜检进行判断。 阴性对照不得有菌生长。
结果判断
⒈若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判 供试品符合规定。 ⒉若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品 不符合规定。 ⒊除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。 ⒋当符合下列至少一个条件时，方可判复试。
和螺杆菌。 ⒋经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大
类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。
真菌（fungus；eumycetes）
是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道 的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的 菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在 基质上生长的形态称为菌落。