D葡聚糖的检验与临床
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Hale Waihona Puke Baidu11
（1,3） - β- D-葡聚糖检测
12
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 13 角鲨烯环氧化酶
1,3-β-D-葡聚糖结构
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成分 50%以上，是真菌细胞壁上的特有 成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄糖残 基骨架作为主链 以分支状1-6-β-D葡萄糖残基作 为侧链
侵袭性真菌感染率上升—
AIDS
1
医学和相关科学的进步
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
2
真菌感染的危险因素：
中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间
真菌抗原检查
真菌特异的代谢产物
真菌 DNA 的检测
9
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
14
1,3-β-D-葡聚糖特性
对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌 和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞 噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释 放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌 在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来， 故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡 氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）
感染之前定殖
3
侵袭性真菌感染
条件致病性真菌
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他
4
诊断方法
影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法：
传统的方法
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）
采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁
18
1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：
使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食 物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。
10
侵袭性真菌感染的诊断标准
EORTC/MSG2008修订版
宿主因素 临床特征 病原学
真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据）
CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
5
真菌病实验室诊断主要内容
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
6
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难
15
“G”试验缘何而来？
16
比浊法反应机理
细菌内毒素 因子C 活化因子C （1-3）b-D-Glucan LAL-RM(反应物)
因子B
活化因子B 活化因子G
因子G
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
定量浊度仪 Turbidimetric technique
GEL
17
分析前注意事项
20
曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）
Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay
21
例1
1,3-β-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较： 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病
中性粒细胞减少症患者40例 （发展为曲霉菌病的高危人群） 该研究选择1,3-β-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病, 但BG可早于 GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗, 其特异性和阳性率均为 100% .
结论： BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染, 并将 单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 .
22 Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005
19
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值
早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。
7
非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检 测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效 评估
8
非培养诊断的方法简介
真菌细胞壁成分
（1-3） - β- D-葡聚糖检测（G试验） 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原 （GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） D-阿拉伯糖醇
（1,3） - β- D-葡聚糖检测
12
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 13 角鲨烯环氧化酶
1,3-β-D-葡聚糖结构
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成分 50%以上，是真菌细胞壁上的特有 成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄糖残 基骨架作为主链 以分支状1-6-β-D葡萄糖残基作 为侧链
侵袭性真菌感染率上升—
AIDS
1
医学和相关科学的进步
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
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真菌感染的危险因素：
中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间
真菌抗原检查
真菌特异的代谢产物
真菌 DNA 的检测
9
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
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1,3-β-D-葡聚糖特性
对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌 和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞 噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释 放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌 在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来， 故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡 氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）
感染之前定殖
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侵袭性真菌感染
条件致病性真菌
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他
4
诊断方法
影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法：
传统的方法
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）
采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁
18
1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：
使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食 物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。
10
侵袭性真菌感染的诊断标准
EORTC/MSG2008修订版
宿主因素 临床特征 病原学
真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据）
CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
5
真菌病实验室诊断主要内容
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
6
镜检和培养方法
敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。
培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难
15
“G”试验缘何而来？
16
比浊法反应机理
细菌内毒素 因子C 活化因子C （1-3）b-D-Glucan LAL-RM(反应物)
因子B
活化因子B 活化因子G
因子G
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白（凝胶）
凝固蛋白原
定量浊度仪 Turbidimetric technique
GEL
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分析前注意事项
20
曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）
Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay
21
例1
1,3-β-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较： 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病
中性粒细胞减少症患者40例 （发展为曲霉菌病的高危人群） 该研究选择1,3-β-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病, 但BG可早于 GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗, 其特异性和阳性率均为 100% .
结论： BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染, 并将 单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 .
22 Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005
19
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值
早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。
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非培养方法优点
快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检 测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效 评估
8
非培养诊断的方法简介
真菌细胞壁成分
（1-3） - β- D-葡聚糖检测（G试验） 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原 （GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） D-阿拉伯糖醇