FTT耐热逆转录酶的特性分析RD—
多酚氧化酶特性研究
多酚氧化酶特性研究 摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。 关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。1材料与方法 1.1材料 板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。 1.2试剂与仪器 主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。 主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。 1.3试验方法 1.3.1粗酶液的制备 酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。 1.3.2褐变度( BD) 的检测 称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL 甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。 将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。 1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测 称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。 1.3.4酶活性的测定 取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用
酶的特性综述
酶的特性综述 酶通常是指由活细胞产生的、具有催化活性的生物大分子，大多数酶是蛋白质，少数是RNA，另有一些需要辅助因子的辅助。酶的特性主要体现在这几个方面： 一、高效性 1、酶的高效性是和非酶的催化剂比较而言。主要是指催化能力，蛋白质（环境适宜）的催 化能力是普通化学催化物质的10^5—10^8倍。生物分子之间的反应首先要进行分子碰撞接触，如果在没有酶作用的情况下，分子主要靠自然的热运动来随机进行接触，这样的几率比较小，而在酶的作用下，由于酶和作用底物有特异性结合位点，相当于把反应需要的分子给拉到一起去了，所以这样的效率要高很多。 2、酶的高效性实验探究 材料： 新鲜猪肝研磨液（含有H2O2酶)、3%的FeCl3溶液（催化过氧化氢分解的化学催化剂）、清水、试管5支、试管架、酒精炉、线香、打火机、量筒 步骤： 1、在5支试管中分别加入5mLH2O2溶液，依次编号置于试管架上。 2、在1号试管中加入一定量的清水；2号试管中加入与清水等量的新鲜猪肝研磨液；3号试管中加入等量的3%的FeCl3溶液；4号试管中加入经过高温煮过的等量的新鲜猪肝研磨液；5号试管中加入高温煮过的FeCl3溶液。 3、用点燃但无火焰的线香插入试管检验。 现象： 氧气量效果 1号：—无催化作用 2号：﹢﹢高效催化 3号：﹢低效催化 4号：—无催化作用 5号：﹢低效催化 结论：过氧化氢酶比FeCl3催化剂高效。酶具有高效性。
二、专一性 酶对所作用的底物有严格的选择性。一种酶仅能作用于一种物质，或一类分子结构相似的物质，促其进行一定的化学反应，产生一定的反应产物，这种选择性作用称为酶的专一性。 酶的专一性是指酶对底物及其催化反应的严格选择性。通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应，不同的酶具有不同程度的专一性，酶的专一性可分为三种类型：绝对专一性、相对专一性、立体专一性；也可分为：结构专一性和立体异构专一性。 如过氧化碳氢酶只能催化过氧化氢分解，不能催化其他化学反应。细胞代谢能够有条不乱的进行，与酶的专一性是分不开的。 探究酶的专一性的实验 序 号 项目 试管 1 2 1 注入可溶性淀粉2mL / 2 注入蔗糖溶液/ 2mL 3 注入新鲜淀粉酶溶液2mL 振荡 4 60℃温水保温 5 min 5 加斐林试剂1mL 振荡 6 将试管下部放入60℃热水 中 2 min 7 观察实验结果有砖红色沉淀无砖红色沉淀结 论 淀粉酶只能催化淀粉水解，不能催化蔗糖水解 三、多样性 酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种；形态上主要有三种：专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。 四、温和性
逆转录病毒
逆转录病毒（Retroviruses）归类于逆转录病毒科（Retroviridae），包括一大类含有逆转录酶（reversetranscriptase）的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、泡沫病毒亚科和慢病毒亚科，每一亚科又有若干个属（表33-1）。肿瘤病毒亚科（oncovirinae）大多引起禽类、猫、鼠、猴等动物肿瘤，与人类疾病相关者有人类嗜T细胞病毒（humanT-celllymphotropicvirus,HTLV）；泡沫病毒亚科（spumavirinae）的致病作用尚不清楚；慢病毒亚科（lentivirinae）中的人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）则是艾滋病的病原体，正受到人类的广泛关注。三个亚科病毒的生物演化和亲缘关系见图33-1。 第一节人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒（HIV），是获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原体。AIDS首次报道于1981年，1984年证实其病原为HIV。因病毒最初分离于淋巴腺综合征的同性恋患者血清，曾称之为淋巴腺病相关病毒（lymphadenopathy-associatedvirus,LAV），此后分别又有人类嗜T细胞病毒Ⅲ型（HTLV-Ⅲ）、AIDS相关病毒 （AIDS-relatedvirus,ARV）之称。1986年经国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）建议，将LAV、HTLV-Ⅲ和ARV统一命名为人类免疫缺陷病毒，俗称艾滋病病毒。HIV分HIV-1型和HIV-2型，前者引起全球AIDS流行，后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者。HIV感染的范围在逐步扩大，我国自1985年发现首例AIDS以来，感染人数逐年快速增长，严重威胁着人类的身心健康，受到人们的广泛关注。 一、生物学性状 （一）形态与结构 成熟的病毒直径100~120nm、20面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶（integrase）和蛋白酶（protease）。HIV的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白（gp120）和相嵌蛋白（gp41）两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17构成的基质蛋白（matrix），其内为衣壳蛋白（P24）包裹的RNA。。 HIV基因组由两个拷贝的正链单股RNA组成，在其5’端可通过氢键结合构成二聚体。HIV的基因组成较其他逆转录病毒复杂，全长约9.7kb，含有gag、pol、env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调控基因（图33-3）。在基因组的5’端和3’端各含长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)，HIV的LTR含顺式调控序列，控制着前病毒基因的表达。在LTR区有启动子、增强子及负调控区。核酸杂交显示，HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。 1．结构基因 （1）gag基因：是编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因。其表达产物初为55kD的前体蛋白（p55），后在HIV蛋白酶作用下进一步裂解为p24、p17和p15。P24组成包裹在HIV核酸外的衣壳蛋白(capsid,CA)，其特异性较强，除HIV-1和HIV-2之间存在轻度交叉反应外，与其他逆转录病毒无交叉抗原成分；p17构成包膜内的基质蛋白；p15则可进一步裂解为与RNA结合的蛋白（p9和p7）。 （2）pol基因：编码HIV复制所需的酶类，诸如逆转录酶（p66/p51）、整合酶（p32）和蛋白酶。Pol基因有万分之一的突变率，对抗叠氮胸苷（具有抗病毒作用的核苷类似物）的HIV突变株的形成，即与pol上HIV逆转录酶基因
酶的特性
酶的特性 第2节一．教材版本及章节普通高中课程标准实验教科书《分子与细胞（必修1）》（人教版）第五章第一节第二部分。二．内容分析酶是生物新陈代谢过程中的重要物质，是多项生物化学反应的联系纽带。光合作用和细胞呼吸这两个过程由许许多多的生物化学反应组成，这些反应都需要酶的参与。因此，本节内容即酶的三个特性是本章的基础。即酶的高效性、酶的专一性及酶的作用条件较温和。本节的“科学·技术·社会”，通过多个侧面，体现出酶与人类社会生活的密切关系。课时安排：一课时三．教学目标①知识目标理解酶的特性；理解酶特性的实质和意义；②能力目标通过多种方式的教学活动，对学生进行思维能力、语言表达能力、分析和实验操作能力以及用学到的生物学知识解决某些实际问题能力的培养；③情感、态度、价值观目标通过参与酶的特性的实践，使学生体验设计对照实验的科学思想，促进质疑、求实、实践的科学精神和科学态度的养成，通过探讨、交流，促进探索、创新、合作精神的养成。四．教学重点酶的特性和实质及影响酶活性的条件的探究方法。五．教学难点组织学生设计，实践，主动探究酶的特性，分析实验结果，准确描述影响
酶活性的各种因素。六．多媒体及实验器材电脑、投影仪、视频展示仪、powerpoint课件；试管、滴管、试管架、火柴、卫生香、酒精灯、试管夹、小烧杯、大烧杯、三脚架、石棉网、温度计、玻璃棒、ph试纸、新鲜的质量分数为20%的肝脏研磨液、稀释200倍的新鲜唾液溶液、新配制的体积分数为3%的过氧化氢溶液、质量分数为3%的可溶性淀粉溶液、质量分数3%的蔗糖溶液、质量分数为5%的盐酸、质量分数为5%的naoh溶液、蒸馏水、热水、冰快、碘液、斐林试剂。各代表展示实验结果 教师提问，适当补充 学生归纳总结，反馈练习 结束 开始 新课导入 酶的特性 分组设计实验方案 回忆推理 教师指导 各代表组介绍实验方案
酶的特性
《酶的特性》说课稿 各位老师：大家好！今天我说课的内容是《酶的特性》。 《酶的特性》是高中生物必修1第5章第1节《降低化学反应活化能的酶》第2课时的内容，本课时通过设计探究实验，进一步理解酶的三大特性，不仅巩固了第1课时酶的作用与本质的内容，也为后面学习ATP的合成与分解、光合作用、细胞呼吸等重要内容奠定了坚实的基础，因此，本节课在教材中起到了承上启下的作用。 本节课的教学对象是高一年级的学生，他们对酶已经有了一定的理论认识，但如何通过设计实验更深入的认识酶，还存在一定的障碍。由此，我制定了以下教学目标： 1、在知识方面：希望通过本节课的学习，使学生能够总结出酶的特性及影响酶促反应的条件，并能分析和应用。 2、能力目标：主要是通过进行有关的实验探究，使学生能够掌握控制变量的方法。 3、情感态度和价值观目标同时，学生能够亲身体会科学发现过程，领悟科学研究方法，培养了他们崇尚科学的态度和实事求是的精神。
明确了教学目标，不难得出本节的重难点。新课标要求学生的学习要注重与现实生活的联系，而酶的特性又与生活息息相关，因此我将酶特性的探究定为本节课的重点。课程标准同时倡导探究性学习，培养学生分析问题解决问题的能力，因此这就需要学生具有严格缜密的思维，但是这对高一学生来说还是比较困难的，因此，我将实验中如何控制变量作为本节的难点。 为了讲清教材的重难点，使学生能够达到本节内容设定的教学目标，我再说说教法： 我们都知道生物是一门培养人的实践能力的重要学科。在教学过程中，不仅要使学生“知其然，还要使学生知其所以然”。因此，我将采用以下教学方法来展开教学： 1活动探究法：在我的指导下，学生主动做实验探究酶的特性，亲身体会科学发现过程，领悟科学探究方法。 2集体讨论法：针对学生提出的问题，组织学生进行集体和分组讨论，促使学生在学习中解决问题，培养学生团结合作的精神。 我们常说：“现代的文盲不是不懂字的人，而是没有掌握学习方法的人。”因而，我在教学过程中特别重视学法的指导，让学生转变，即：从“学会”向“会学”转变，成为真正的学习的主人。本节课将采用自主、合作、探究的学习方式来培养学生合作意识创新意识。学生先
逆转录酶(AMV)使用说明
逆转录酶（AMV）使用说明 货号：RT1060 规格：200U/500U/1000U 保存:-20℃保存，避免反复冻融，保质期为2年。 产品内容： 产品组成RT1060-200RT1060-500RT1060-1000逆转录酶（AMV）20μl50μl100μl 10×AMV Reaction Buffer50μl150μl300μl DTT30μl80μl150μl 产品简介： 逆转录酶（AMV）从Avian Myeloblastosis Virus分离出来，经过高度纯化，不含核酸酶。可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。 逆转录酶（AMV）一个活性单位U定义为：在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。 使用说明： 合成第一链cDNA的步骤 以下试剂客户自己提供 dNTPs(10mM)
引物（Oligo dT（18）或随机引物或特异性引物 无核酸酶双蒸水 RNA模板 RNase抑制剂 RT反应（20μl体系）： 1．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s； 2．取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入 2~5μg RNA Xμl 引物*1μl 【引物*：Oligo dT18(10μM)或随机引物(50ng/μl)或特异性引物(2μM)】 dNTPs(10mM)1μl 补加无核酸酶的双蒸水至总体积15.5μl 3．65℃保温5min，然后冰浴5min； 4．往步骤3的PCR管中依次加入下列组份 RNase抑制剂(40u/μl)0.5μl 10×AMV Reaction Buffer2μl DTT(200mM)1μl
酶地特性-教案设计设计
课题：酶的特性 〖课标与教材分析〗 “酶的特性”是人教版高中《生物》（必修1分子与细胞）第5章“细胞的能量供应和利用”第1节“降低化学反应活化能的酶二”的内容。本节课在高中生物中起着承上启下的作用，它以必修1中的“蛋白质的功能”等知识为基础，为以后学习必修1中的“细胞呼吸”、“光合作用”、必修2中的“基因的本质”、“基因的表达”、必修3中的“内环境稳态的重要性”以及选修部分等相关内容打下基础。 本节基本知识相对比较简单，但其潜在的知识和能力要求比较高。对照实验规范、变量分析能力和生物学研究思想的领悟是本节关键。这些都是新课程中探究性学习必须具备的素质。教师利用教材资源，加强学生实验能力的训练非常必要。 〖学情分析〗 本节课授课对象为高一年级学生，对细胞内的化学反应了解较少，但经过前阶段的学习，学生已具备了“催化剂”“新陈代谢”“科学探究的一般程序”“对照实验的设计与操作方法、自变量和无关变量的分析与控制方法”等基础知识。然而，有关影响酶条件的实验方案设计，对学生而言，要求较高，仍存在相当大的困难，为此采取议论加引导的教学设计思路来突破这一难点。 〖教学设计〗 一、教学目标 1、知识目标 举例说明酶的特性。 2、能力目标 进行相关探究实验设计，学会控制自变量，观察和检测因变量的变化，及设计对照组和重复实验。 3、情感、态度、价值观 通过实验探究影响酶活性的条件，培养学生的探索精神、创新精神及团队精神。 二、教学重点与难点
1、重点：酶的特性 2、难点：探究“影响酶活性的条件”的实验设计。 三、教学策略及方法 老师讲授；学生探究；小组讨论及师生讨论。 四、教学用品 多媒体教室、一袋加酶洗衣粉 五、教学过程 创设情境、导入新课。 观看1 min的视频“福缘地生物酶洗涤剂宣传沙画”，导入新课，酶是什么，有什么特性？ 学生活动1：生活中哪些地方用到酶？学生畅所欲言，人人参与。 图片演示：如加酶洗衣粉、多酶片、生物酶牙膏等。 学生活动2：5分钟预习课文并思考（1）我们在使用加酶洗衣粉时，用哪种水（如凉水、温水、沸水）浸泡好呢？（2）高烧时为什么人往往没有胃口？ 多媒体演示：课堂评价（竞答） 科学家不断探索，不断实验，共同努力终于揭开酶的“面纱”。 请给酶下一个较完整的定义。学生分组竞答。 教师活动：指定小组回答，教师评价学生从来源、功能、本质等方面给酶下了一个较完整的定义，表述很准确，小组加10分。 学生活动3：快速齐读，圈点画批。 酶是活细胞产生（来源）的一类具有催化作用（功能）的有机物，绝大多数酶是蛋白质，少数的酶是RNA（本质）。 酶的催化功能与无机催化剂有什么不同呢？举例说明 （一）、酶具有高效性 资料1：在研究酶性质的过程中,科学家通过整理大量的实验数据,发现酶的催化效率大约是无机催化剂的107-1013倍。 分析资料得出酶具有高效性。 回顾过氧化氢在不同条件下的分解实验。放小视频，通过比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率，学生得出酶具有高效性。怎样设计实验证明酶的高效性？
酶工程及酶的特性
●首先对酶进行了命名 1878年库尼首先把这种物质称为酶。 1896年巴克纳兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。 1982年 Cech 、1983年Altman等分别发现核酶。 ●什么是酶工程？酶的生产与应用的技术过程成为酶工程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。 酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的美，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 ●酶的化学本质已知大多数酶的化学本质是蛋白质核酶是核糖酶 酶的专一性（特异性） 是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。1.绝对专一性 一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。例如，乳酸脱氢酶催化丙酮酸进行加氢反应生成L-乳酸；而D-乳酸脱氢酶却只能催化丙酮酸加氢生成D-乳酸。 2.相对专一性 一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。例如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。 ●测定酶活力，应测定酶促反应的初速率。（即底物消耗量<5％时测得的反应速度） 测酶活的步骤 （1）根据酶的专一性，选择适宜的底物 （2）确定反应条件 （3）在一定的条件下，将一定量的酶液与底物混合均匀，记下开始反应的时间。 （4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量，计算酶的活力。 ●终止酶反应的方法 ●酶的活力单位 酶活力单位：是指在特定条件下，在1min内能转化1微摩尔底物的酶量，或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。 ●酶的比活力——是指在特定的条件下。每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。 ●酶的分类 （1）从化学组成上看，分为两类： ?单纯酶（单成分酶）和结合酶（双成分酶） ?结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子 ?辅因子：辅基、辅酶。辅基与酶蛋白结合的更牢固 （2）根据酶蛋白的结构特点：单体酶和寡聚酶 （3）根据酶在代谢中所处的地位、含量与活性情况，将酶分为：恒态酶和调节酶恒态酶：是指构成代谢途径和物质转化体系的基本组成成分，在细胞中的含量相对恒定，其活性仅受反应动力学系统本身的组成因素调节。 调节酶又分为潜态酶、别构酶、同工酶和多功能酶 潜态酶：是指通常以无活性的酶原状态存在，而在机体需要时再转变为活性状态的酶。 别构酶:在结构上除了具有能和底物相结合、并催化底物进行反应的活性中心外，还具有能和效应物
逆转录和逆转录酶
逆转录和逆转录酶 1.逆转录酶的发现 在1970时，当科学家霍华德·马丁·特明和戴维·巴尔的摩两人各自都从酵素中发现反转录的反应，将此命名为逆转录酶，此种反转录的机制才被当时的主流接受。 逆转录酶首先是由霍华德·马丁·特明在劳氏肉瘤病毒中发现的，并且1970在麻省理工学院由戴维·巴尔的摩独立从两种R N A肿瘤病毒：R-M L V 以及在一次劳氏肉瘤病毒中分离出来。由于这些成就，两人在1975年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。 后来发现，逆转录酶不仅存在于某些R N A病毒，也存在于哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞。 2.逆转录的过程 逆转录酶的作用是以d N T P为底物，以R N A为模板，t R N A(主要是色氨酸t R N A)为引物，在t R N A3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与R N A模板互补的c D N A单链，它与R N A模板形成R N A-c D N A杂交体。 随后又在逆转录酶的作用下，水解掉R N A链，再以c D N A为模板合成第二条D N A链。至此，完成由R N A指导的D N A合成过程。 逆转录的简单过程 3.逆转录酶的生理功能 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖R N A的D N A聚合酶，即以R N A 为模板催化D N A链的合成。合成的D N A链称为与R N A互补N A（c D N A）。大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下三种活性。 （1）D N A聚合酶活性以R N A为模板，催化d N T P聚合成D N A的过程。此酶需要R N A为引物，多为赖氨酸的t R N A，在引物t R N A3'－末端以5' →3'方向合成D N A。 （2）R N a s e H活性（R N A酶）由反转录酶催化合成的c D N A与模板R N A 形成的杂交分子，将由R N a s e H从R N A5'端水解掉R N A分子。 （3）D N A指导的D N A聚合酶活性以反转录合成的第一条D N A单链为模板，以d N T P为底物，再合成第二条D N A分子。 除此之外，有些逆转录酶还有D N A内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体D N A中有关。 4.研究意义
酶的特性
第2课时 酶的特性 班级 姓名 【学习目标】 1.阐明酶的高效性、专一性和作用条件较温和。 2.通过探究“影响酶活性的条件”发展科学探究能力。 【基础感知】 一、酶的特性 1．酶的特性及验证实验 (1)酶的高效性 含义：酶的催化效率比 高很多，大约是 的107～1013倍。 意义：可以使生命活动更加高效地进行。 (2)酶的专一性 含义：每一种酶只能催化 化学反应。如过氧化氢酶只能催化 分解。脲酶除了催化 分解外，对其他化学反应不起作用。 意义：使细胞代谢能够有条不紊地进行。 (3)酶的作用条件较温和 酶所催化的化学反应一般是在 的条件下进行的。过酸、过碱或温度过高，都会使酶的 遭到破坏，使酶永久 。低温只能使酶活性降低，不会使酶失活。 特别提醒 酶与无机催化剂的共同点 (1)只改变化学反应速率，不改变化学反应的方向。 (2)不为化学反应提供物质和能量，本身不被消耗。 (3)降低化学反应的活化能，使反应速率加快，缩短达到平衡点的时间。 2．酶特性的验证实验 (1)酶高效性的实验分析 实验组：底物＋ →底物分解速率(或产物形成的速率) 对照组：底物＋ →底物分解速率(或产物形成的速率) (2)酶专一性的实验分析 ①? ???? 实验组：底物＋相应酶液――→检测 底物被分解对照组：另一底物＋相同酶液――→检测底物没被分解 ②? ???? 实验组：底物＋相应酶液――→检测底物被分解对照组：相同底物＋另一酶液――→检测底物没被分解
③实例：实验验证淀粉酶具有专一性 ①效率更高；率，不改变生成物的量 ①率比未加酶时明显加快，A 入酶同，说明酶二、探究影响酶活性的条件 1．酶活性的含义：酶对化学反应的 。 2．探究酶活性的适宜条件 思路： ? ????底物＋t 1(或pH 1)＋酶液底物＋t 2(或pH 2)＋酶液 ? ? ? 底物＋t n (或pH n )＋酶液――→检测 底物分解速率或剩余量 实例：
逆转录试验说明
逆转录实验说明 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及
高产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性试验
高产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性试验 Selection of high xylanase yielding bacterium strain and its enzyme producing property 虢国成 GUO Guo-cheng （长沙理工大学生物与食品工程学院，湖南长沙410076） （College of Biology and food Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha,Hunan410076,China） 摘要：寻找一种新的产木聚糖酶菌并从整体上降低木聚糖酶的生产成本.本试验以湖南岳阳某厂的土壤为样品，利用透明圈比较法和DNS法相结合，筛选出26株产木聚糖酶菌，并从中分离、纯化出一株高产木聚糖酶菌—S6，通过对S6菌株的发酵条件和产酶规律的试验,结果表明：S6菌株产酶的最优条件是以自制玉米半纤维素为碳源、添加0.2%硝酸铵、pH值为5.5浓度为0.01mol/L的柠檬酸－磷酸二氢钠缓冲体系的培养基中，28℃培养75h，菌生长进入对数期，酶活最大，达到156.2 U/mL。 关键词：高产木聚糖酶菌；筛选；产酶特性 Abstract:Objective and methods:Taking sample from Hunan Yueyang Pulp and Paper-made Factory and Yueyang Tree Cultivation Factory as raw materials,a strain of high xylanase yielding bacteria was screened and purified from26strains of xylanase yielding bacteria by means of clearing halo comparison and DNS.Results: Optimal fermentation condition and property of enzyme producing were investigated, experimental results showed that the optimal fermentation condition of S6is as follows:using the corn as the sole carbon,adding0.2%NH4NO3with a pH value of 5.5,0.01mol/L concentration of citric acid-NaH2PO4solution,cultivation temperature of28℃in loarithmic phase fors75h.Conclusion:Bacterium strain possessing a enzyme activity of156.2U/mL was achieved. Keyword:High xylanase yielding bacrerium;Screen;Enzyme producing property 木聚糖是一种多聚五碳糖,是半纤维素的一种主要成分,在自然界中占植物干重的35%，是自然界中第二丰富的再生物质资源[1～2]。微生物产生的木聚糖酶能将木聚糖水解成寡聚木糖和木糖[3～4]。现已广泛在饲料工业,造纸业，印染工业，食品工业等中[5]。 本试验采集湖南岳阳造纸厂和岳阳锯木厂的土壤样品，经以自制玉米芯半纤维素为唯一碳源的筛选培养基选择培养，分离出耐酸性高产木聚糖酶菌，通过对该菌性质和培养条件的优化试验，为更好的把握菌种产酶情况，寻找一种新的产木聚糖酶菌和从整体上降低木聚糖酶的生产成本提供一定的理论基础。 1材料与设备 1.1试验原料 ______________________________ 作者简介：虢国成(1958-)，男，长沙理工大学生物与食品工程学院讲师。 E-mail:guoguocheng2006@https://www.360docs.net/doc/8d3950608.html, 收稿日期：2008-01-27
海洋细菌thalassobacter stemotrophicu纤维素酶的产酶特性研究开题报告
毕业论文开题报告 生物工程 海洋细菌thalassobacter stemotrophicu纤维素酶的产酶特性研 究 一、选题的背景与意义 纤维素是高等植物细胞壁的主要组成成分，并且是自然界中含量最丰富的多聚糖类物质，地球上每年光合作用可产生大于100 亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，属于糖苷水解酶，传统上被分为3 类组分：内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase, EC 3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（exo-l,4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.91）、β- 葡萄糖苷酶（β-l,4-D -glucosidase，EC 3.2.1.21）[3]。这三种酶协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解产物为葡萄糖。纤维素酶在医药、日用化工、食品发酵、废水处理、工业洗涤、中草药提取、以及畜牧饲料等领域都有广泛的应用。以往纤维素分解菌的研究多集中在真菌，而对细菌的研究很少见诸报道。 纤维素酶在食品工业中的应用 （1）果实和蔬菜加工：用纤维素酶进行果蔬处理可使植物组织软化膨松, 能提高可消化性并改良口感，降低生产成本。 （2）油料作物加工：酶处理法代替有机溶剂法, 一方面可以提高油的产量和质量; 另一方面, 控制酶反应条件, 使生产加工在较温和的条件下进行, 可以避免剧烈条件对产品质量的影响，不仅能提高主产物的产量,还能减少副产物的生成和降低废物处理费用 （3）茶叶加工：将纤维素酶加入砖茶中,缩短渥堆时间, 减少有效成分的损失, 提高水浸出物和可溶性糖的含量, 改善砖茶的品质及发展香气 酒精生产：使用纤维素酶,可同时将淀粉和纤维素转化为糖, 原料利用率提高,再经酵母分解全部转化为酒精,发酵过滤性好, 发酵时间缩短, 出酒率提高3%～5%, 且酒体质量纯正, 淀粉和纤维素利 用率高达90%, 还可降低醪液的黏度(降低2～4 倍)。利用纤维素酶进行酒精浓醪发酵, 前景也十分看好。 （4）啤酒生产：将纤维素酶应用于啤酒工业的麦芽生产中, 可增加麦粒溶解性, 加快发芽, 减少糖化液中β- 葡萄糖含量, 改进过滤性能 食醋生产：在食醋酿造过程中, 将纤维素酶与糖化酶混合使用,可明显提高原料利用率和出品率。（5）酱油生产：酱油的天然酿造除了用蛋白酶、淀粉酶等各种酶作用的方法, 在入池发酵时加入纤维素酶, 可使大豆类等原料的细胞膜膨胀软化破坏, 使包藏在细胞中的蛋白质、碳水化合物释放,
关于逆转录试剂的那些事
关于逆转录试剂的那些事 逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。 逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA 互补DNA(complementary DNA,cDNA)。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 逆转录酶 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 BIOG Super Reverse Transcriptase是公司美国团队在西雅图的实验室研发出的一款具有卓越性能的逆转录酶。利用基因工程技术，我们成功地将BIOG Super的热稳定性大幅提高，即使在摄氏50多度时也有较好的逆转录表现，从而有效克服了RNA模板二级结构对逆转录反应的影响。与其它品牌的逆转录酶相比，BIOG Super与RNA模板具有更高的亲和力，更容易获得完整的cDNA片段，并可检测到低至1pg总RNA 中的目标片段，特别适合于总RNA量较少以及目标RNA拷贝数较低情况下的逆转录。 成分反应体系 组分2000单位10000单位 5×BIOG RT Buffer500ul500ul BIOG Super Reverse Transcriptase 10ul50ul RNase free ddH2O to20μl 5×BIOG RT Buffer4μl dNTP Mixture(10mM each)1μl Gene Specific Primers(2μM)1μl RNase inhibitor(40U/μl)1μl BIOG Super Reverse Transcriptase1μl 模板RNA100pg-5μg
优质课酶的特性教学设计
《酶的特性》教學設計 宗健康山東省福山第一中學 一、教材分析 “酶的特性”是《普通高中課程標準生物教科書分子與細胞（必修1）》（人教版）第五單元第一節《降低化學反應活化能的酶》第二課時的內容。本節教材內容包括“酶具有高效性”、“酶具有專一性”、“影響酶活性條件的探究與分析”三大內容。其中“酶具有高效性”的內容，在前一課的“比較過氧化氫在不同條件下的分解”實驗中學生已自我構建。有關“酶具有專一性”的內容，隱含著同一種酶對不同底物的作用和不同的酶對同一種底物的作用的內容，對于這一內容，只要引導學生對前一節所學實驗就底物和酶進行改變，通過親自實驗及分析，很容易突破。因此，“影響酶活性的條件”的探究實驗是本節課的重心所在，而這一內容所包含的實驗方案設計、實驗操作過程及實驗結果分析，既是前面所學的“酶的作用與本質”知識的延續和進一步理解，又是學生以后學習影響光合作用和呼吸作用因素知識與技能的基礎，同時又是培養學生生物科學研究素養非常好的內容，對學生學習與研究生命科學的興趣將產生較大的影響。 二、學情分析 本節課之前，學生學習了第1課時“酶的作用和本質”，結合初中學習的人體內消化酶知識，學生已具備了以下與本節學習相關的知識和技能基礎，即對照實驗的設計與操作方法、 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
自變量和無關變量的分析與控制方法。然而，對科學探究的一般程序“提出問題→作出假設→設計實驗→進行實驗→分析結果，得出結論→表達和交流→進一步探究”還缺乏理論性的指導，有關影響酶條件的實驗方案設計，特別是細節問題：如底物的選擇、指示劑的運用等，對學生而言，要求較高，存在相當大的困難，為此采取學生討論和教師引導結合的教學設計思路來突破這一困難。 三、教學設計思路 酶的特性這一節的教學，是在對酶的作用和本質有了初步認識的基礎上，通過實驗，對酶的催化作用做進一步的認識。由于本節課內容與生活貼近，實驗性強，所以本節課內容適宜進行探究性學習。探究性學習是學生自主獲取知識的學習方式，其突出特點是強調學生“親歷”。通過鉆研教材，我挖掘了較多的探究內容，對于酶的專一性，課本是以呈現的方式給出，為了使學生從“聽和背”中解脫出來，我設計了專一性探究實驗。 我的設計思想就是盡可能為學生提供親身體驗“做科學”的機會，使學生通過探究形成自己的觀點，而不是全盤接受他人的結論，真正從“聽和背”中解脫出來，實現“做中學”我的設計目的就是通過實驗探究，在探究中學習科學解決問題的方 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究
碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究碱性蛋白酶(alkaline protease)是一类最适pH为碱性的蛋白酶,是一种非常重要的水解酶类,在医药、饲料、食品等领域中都有广泛应用。本论文以Cellulomonas bogoriensis sp.nov为出发菌株,对其产酶条件、碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质等方面进行了研究,并得到以下结论:利用单因素法和响应面Box-Behnken组合设计方法对菌株产碱性蛋白酶的发酵条件进行了优化,得出菌株最佳产酶条件为:培养温度30℃,培养基初始pH 10.5,装液量75/250 mL,1.5%(w/v)蔗糖为碳源、1.5%(w/v)的牛肉膏酵母浸粉(1:1)为混合氮源、NaCl 含量为2.67%(w/v),培养时间120 h。 经硫酸铵分级沉淀和CM Sepharose Fast Flow柱层析纯化得到一个相对分子质量约为18.3 kDa的碱性蛋白酶,纯化倍数为10.83,回收率为25.79%。酶的最适反应温度70℃,最适pH为11.0。 在4-60℃、pH3.0-12.0范围内酶活力稳定;1 mM的Mg2+、Fe2+会增加蛋白酶活力;而1 mM的Ba2+、Mn2+、Ca2+对蛋白酶活力几乎没有影响,但在10mM时会明显抑制蛋白酶的活力。EDTA浓度为10m M时,碱性蛋白酶的酶活力仍能达到77%。 抑制剂PMSF,TPCK对酶有强烈的抑制作用,表明该酶属于丝氨酸蛋白酶家族中的胰凝乳蛋白酶。酶对甲醇、乙醇、甘油等有机溶剂具有较强的耐受能 力,Triton X-100强烈抑制酶活力。 该蛋白酶最佳作用底物为酪蛋白,可以水解血红蛋白和牛血清白蛋白,不能水解明胶和胶原蛋白,米氏常数Km为19.2μg/mL,Vmax为2000μg/min。该蛋白酶与市售的洗涤剂均有良好的相容性,具有良好的脱毛效果、处理血污的能力和
逆转录
逆转录-聚合酶链反应中文实验方法 作者：佚名来源：本站原创 2004-12-20点击：6478 【字体：小大】 逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为4 2℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cD NA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的