乳酸菌的培养检测方案

品质管理检测项目

细菌形态学分类

一乳酸杆菌

乳酸杆菌的基本属性：

乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。

无芽孢，革兰氏染色呈阳性。微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。

（一）实验仪器和试剂：

实验仪器：

现有的仪器：

欠缺的仪器：

培养基和试剂：

①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基

BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；

MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋

白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。

乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。

乳酸杆菌在液体培养基中的生长状况

背景资料：

培养基有MRS培养基、RS MA培养基、番茄汁琼脂培养基。当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS培养基对其进行分离。一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等在MRS培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离难度。目前MRS培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

番茄汁琼脂培养基，这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基，此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。

某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT( All Purpose Tween) 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的Rogosa SL( Rogosa Sodium Lactate Modified ) 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离。Briggs琼脂培养基和s L( Sodium Lactate) 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌分离。

（二）检测内容、流程、方式：

内容：1 通过对水体当中的的乳酸杆菌的筛选培养，最后计数得到相应水体当中的乳酸杆菌的数量。方法为：逐级稀释法。2 乳酸杆菌的定性

流程：

①采集：每个采集点各自采集10ml的池塘水，经过过滤杂质（固体），冷冻运送等环节送到实验室内部。

②稀释平板测数法

1、样品稀释液的制备

准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－

4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。

2、平板接种培养

平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

⑴混合平板培养法

将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1mL放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。

⑵涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

⑶划线法（不采用，因为需要对乳酸菌和大肠杆菌进行筛选培养）：

用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。

以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50µg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。

3、培养（16个小时即可）