微生物的接种、分离和培养

实验六微生物的接种、分离和培养

一、目的要求

1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。

2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。

3．了解微生物需氧培养的方法。

4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。

二、实验原理

1. 微生物接种

指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。

2. 微生物分离

指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。

平板分离法的基本原理包括两个方面：

（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某

种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

3. 微生物培养

指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。

4. 微生物的培养形状

培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。

菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的内眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。若所用培养基、培养温度和时间等条件相同，则同一种菌所形成的菌落形态具有相对的稳定性和专一性。

三、实验材料

1. 菌种大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），毛霉(Mucor sp.)，根霉（Rhizopus sp.），黑曲霉，青霉(Penicillium sp.)，混合菌液。

2. 培养基营养琼脂斜面和平板，半固体营养琼脂直立柱，PDA 斜面和平板。

3. 接种工具接种环，接种针，涂布棒，无菌吸管等。

4. 其他酒精灯，生化培养箱等。

四、实验方法与步骤

（一）实验项目

接种前的准备：接种的试管、培养皿等应做好标记，注明菌种的名称，日期、接种者等。

表6-1实验项目

实验项目所用菌种

所用培养基

方法提示

名称用量

分

离

方

法

2.稀释倾

注平板

分离法

大肠杆菌营养琼脂平板1皿

①取稀释好的菌液1mL加入

灭菌的空平皿内

②加入15mL45℃的融化琼

脂，水平转动平皿

3.稀释涂

布平

板

分离法

大肠杆菌

营养琼脂平板1皿

取稀释好的菌液加入到平板

上→用灭菌涂布棒涂开涂匀（二）各种接种方法的操作步骤

所有待接种的培养基在接种前都要先贴好标签，整个接种过程都必须在酒精灯旁进行。

1．斜面接种

斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：

（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后才能点燃酒精灯。

（2）用斜面进行接种时，将原菌种管和待转接斜面试管夹在左手的大拇指和其它四指之间，斜面朝上，并处于水平位置。（图6-1，1）

1 2 3

4 5 6

图6-1 斜面划线接种示意图

（3）先将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）右手拿接种环（与日常拿笔一样）在火焰上将环金属丝部分烧红灭菌，然后将其

余要伸入试管部分的金属柄也反复通过火焰灭菌。（图6-1，2）

（5）用右手小指、无名指或手掌将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞同时拔出并把硅胶塞握住，不得任意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口（图6-1，3）。

（6）将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，接种环在接触菌种前先在试管内壁上或未长菌落的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种，然后用接种环轻轻沾取少量菌苔，接着将接种环自菌种管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿通过火焰（图6-1，4）。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面试管中，自斜面培养基底部向上划线，使菌体沾附在培养基的斜面上，划线时环要平放，勿用力，否则会使培养基表面划破（图6-1，5）

（8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧一下管口，塞上硅胶塞，塞棉塞时勿要用试管口去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。（图6-1，6）。

（9）接种环放回原处前要在火焰上彻底灭菌，接种致病菌时更要注意这点。将棉塞旋紧。注意：棉塞与火焰的距离要适当，以免棉塞燃烧。

2．穿刺接种

（1）操作方法见图6-2，可以水平穿刺，也可以垂直穿刺，所使用的接种针要笔直。

（2）将接种针自培养基中心刺入，直到接近管底，但勿穿透，然后沿原穿刺途径慢慢拔出。

图6-2 穿刺接种示意图

3．平板接种

（1）划线接种见分离划线法。

（2）涂布接种用无菌吸管吸却菌液注入平板后，用灭菌的玻璃在平板表面作均匀涂布

（图7-3）。

（3）三点接种法

①标明三点位置：欲使点接的三点分布均匀，可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。

②取接种针：拿接种针，先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。

③沾取孢子：将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管,用针尖沾取少量霉菌孢子。