细菌分子鉴定

细菌的分子鉴定

一、染色体DNA提取和纯化（细菌不同，方法略有不同）

1)4ml培养物1000rpm离心5min

2)用等体积0.85% NaCl洗涤，离心

3）用等体积TES缓冲液洗，离心

4）悬浮于0.4mlTE(pH8.0)缓冲液

5）加入50ul新鲜配制的溶菌酶液(2mg/ml in TE),悬浮于30℃处理20min，并且加入RNase，使终浓度为20ug/ml.

6)加入20ul 25%SDS和50ul 5mg/ml蛋白酶K和50ul 5M NaCl 37℃处理1h。悬液黏度增高，表明裂解。

7）加入10%体积的3M pH5.2乙酸钠溶液，轻轻混合。

8）加入等体积酚：氯仿，颠倒离心管慢慢混合15～30min，10，000rpm离心8min。

9）轻轻吸出上层（DNA很粘稠，可将tip剪成较大口），酚：氯仿抽提，直到看不见蛋白层。

10）加入等体积异丙醇沉淀DNA，可见盘曲线状物。

11）将DNA移至一小离心管中离心，用70%乙醇洗两遍；气干或真空干燥，然后用100～200ulTE缓冲液融解。

二、 PCR扩增16S rRNA基因

以227＃菌株的总DNA为模板，以F8: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和

R1492: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’为引物扩增其16S rRNA基因。PCR反应在20ul反应体系中进行。同时，以水做阴性对照。

10×缓冲液 2ul

dNTP 2ul

引物F8 2ul

引物R1492 2ul

Taq酶 0.15ul

O 11.75ul

H

2

模板 0.1ul

PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃，1min；60℃，1min；72℃，2min；

循环30次；72℃，5min

三、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

1）配置用于灌注电泳槽和制备凝胶所需的电泳TAE缓冲液；

2）按体积称取1%(w/v)的琼脂糖，加TAE缓冲液；

3）在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；

4）冷却至60℃左右，加入EB溶液，使之终浓度为0.5ug/ml；

5）将溶液倒入胶膜中，插入胶疏，静置冷却；

6）待凝胶完全凝结后，小心将胶梳取出，将凝胶放入电泳槽中；

7）将样品与缓冲液(Loading Buffer)充分混合后加入样品槽；

8）接通电源，维持电压120V，直到适当时间；

9）切断电源，将凝胶于紫外灯下观察，并用紫外成像仪拍照。

四、 DNA片断的回收纯化

采用TaKaRa Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit回收纯化DNA。

1）DNA样品经琼脂糖凝胶电泳后，将目的DNA片断切出。

2）将含有DNA片断的胶块切碎后放入1.5ml的Microtube中。

3）向装有胶块的Microtube中加入约3倍凝胶量（体积比）的NaI溶液(1mg 凝胶视为1ul)，55℃加热使胶块完全融化。

4）按每20ul硅胶树脂结合约1ug DNA的比例加入适量的硅胶树脂，充分混合后，于室温放置20分钟。

注）硅胶树脂使用前，一定要充分混匀。

5）离心(10,000rpm、1分钟)后除去上清液。

注）此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可废弃。如果回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新吸附。

6）在Microtube中加入500ul清洗液，振荡混匀后离心(10,000rpm、1分钟)，除去上清液。

7）重复操作第6步。

注）为提高DNA片断的回收效率，此时应尽量除净上清液。

8）加入和硅胶等量（体积比）的TE缓冲液或灭菌蒸馏水后混匀，55℃水浴

中放置10分钟。

9）离心（10,000rpm，1分钟）后吸取上清液，注意尽量不要吸取硅胶树脂。此回收上清液即为DNA回收溶液。

注）为提高回收效率，可再重复一次第8步和第9步的操作。

五、扩增的16S rRNA基因克隆于质粒载体上

扩增的16S rDNA首先在0.8%低熔点琼脂糖胶上纯化，纯化的DNA和质粒pUCm-T Vector在16℃连接16h，然后转化入E.coli DH5α，转化子在含X-gal 和氨苄青霉素的LB平板上筛选。

1连接反应

基本操作按连接酶说明书进行，外源目的DNA片断与载体DNA比例为3:1，O，外源DNA片断，载体DNA，连接缓冲液，T4 DNA连接酶

按比例加入ddH

2

(Promega)，16℃连接16hr，用琼脂糖凝胶电泳检测连接效果。

2大肠杆菌感受态的制备和质粒的转化

（1）大量制备感受态细胞

1）从37℃培养12-16h的平板中用无菌牙签挑取一个单菌落，转到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈振荡培养约2-3h(振摇速度为200rpm)，待OD600值达到0.3-0.4时将烧瓶取出立即置冰浴10-15min。

2）自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的用冰预冷的50ml离心管中。

3）4℃离心，4000g×10min回收细胞。

4）弃去培养液，将管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。

10ml重悬菌体，置冰浴30min。

5）加用冰预冷的0.1mol CaCl

2

6）4℃离心，4000g×10min，弃去上清液，倒置于滤纸上1min。

重悬菌体。（重悬时操作要轻）。

7）再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl

2

8）置4℃冰箱置12-16h，即可应用于转化。

（2）感受态细胞的冻存

如一次制备出的感受态不能用完，可进行冻存保留。其方法为：将感受态分装成400ul一份，每份加30%体积的甘油保存液。置-70℃冰箱，低温保存可达3