长期高糖导致岛β细胞功能损伤的分子机制

（Ｐ＜０．００１），Ｂ组约为Ａ组的７０％（Ｐ＜０．００１），Ｃ组与Ｂ组比较也降低了 ２０％（Ｐ＜０．０１）。同一组内与第一周比较Ｂ组到第４周时ｍＲＮＡ较前三周
均下降，而ｃ组至第３周起即开始下降，约为第一周时的６７％（Ｐ＜０．叭），
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至第４周时降至第一周时的４５％（Ｐ＜０．０５），Ｃ组的第４周与第三周比较
４ Ｗｅｓｔｅｎ免疫印迹分析检测第４周末三组的ＩＤＸ一１的蛋白表达量。 ５间接免疫荧光和免疫组化染色显示ＩＤＸ一１在不同状态下下细胞内 的原位表达（Ｎ＝６）。
结
果
１大鼠胰岛接种４８ｈ后，于倒置显微镜下可观察到形态均一的上皮样 细胞，大多数细胞胞浆丰富、生长情况良好，经台盼兰染色显示：胰岛细胞成 活率为９０％以上。ＤＴＺ染色多着红色。
周末较前三周下降约５０％，Ｃ组的１０ｍｉｎ分泌量自第３周起递减，（Ｐ＜０． ０１）。１ｈ分泌量在第４周时较前三周有所下降。（Ｐ＜０．０５）。
５各组在不同时间１００ｎＭ胰岛素刺激５ｒａｉｎ时的胰岛素分泌量 ｃ组在第４周时开始下降，较Ａ组下降约２５％（Ｐ＜０．０５），较前三周时
．２·
下降约２０％（Ｐ＜０．０１）。
也有明显差别（Ｐ＜０．０１）。 ７ ２２．２ｍＭ的高糖孵育４周使胰岛Ｂ细胞经胰岛素刺激后Ｐ８５ａ的蛋
白表达水平较对照组减低约３０％（Ｐ＜０．０１），而１１．１ｍＭ的葡萄糖作用４ 周对Ｂ细胞经胰岛素刺激后Ｐ８５０ｔ的蛋白表达无明显抑制。
ＲＴ—ＰＣＲ检测上述三组细胞在不同时间时的胰岛素ｍＲＮＡ水平（ｎ＝４）。 ２利用免疫沉淀、及Ｗｅｓｔｅｒｎ技术检测上述三组细胞第４周末时Ｐ１３Ｋ
的ｐ８５亚单位的蛋白含量以及与ＩＲＳ一１／ＩＲＳ一２的结合的ｐ８５的蛋白含 量、磷酸化的ＰＫＢ的蛋白含量（Ｎ＝４）。
３半定量ＲＴ—ＰＣＲ检测培养至第３、４周的三组细胞的ＩＤＸ一１的ｍＲ— ＮＡ表达量（Ｎ＝４）。
６随着孵育糖浓度的增高及孵育时间的延长ｔ３细胞的胰岛素刺激后的
胰岛素基因表达下降。
‘
在第１、２周末，三组的ｍＲＮＡ表达均无明显差别（Ｐ＞０．０５）；至第３周
末，Ａ、Ｂ两组元明显差别（Ｐ＞０．０５），Ｃ组明显降低（Ｐ＜０．００１）。第４周 时，三组的ｍＲＮＡ表达呈现明显的不同，其中Ｃ组最低为Ａ组的５０％以下
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论文作者签名：吐丝￡兰 日期： ）”ｊ。Ｓ．砷
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２胰岛细胞收获量、纯度及成活率分别为１２９９．２２±１１６．３７个胰岛／胰 腺；８８．６±２．３％；９４．４１±１２．２％。
３胰岛细胞的胰岛素分泌功能 培养的胰岛细胞在基础条件下和ｔ６．７ｍｍｏＬ／Ｌ的葡萄糖刺激１ｈ后胰 岛素分泌量为４６±７．３ ｕＵ／１０ ｉｓｌｅｔｓ；２９１±２４ｕＵ／１０ ｉｓｌｅｔｓ；糖刺激后的胰岛 素分泌量约为基础状态时的５倍（Ｐ＜０．０１）。 ４经三个梯度糖浓度孵育后各组胰岛细胞在１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖刺 激１０ｍｉｎ和１ｈ后的胰岛素分泌量 在第１、２同时Ａ、Ｂ、ｃ三组的两个时相的分泌量元明显差别。第３周 时Ｃ组的１０ｍｉｎ分泌量较Ａ、Ｂ两组均减少（Ｐ＜０．０１），ｌｈ分泌量三组仍元 差别，第４周时Ｂ组的１０ｍｉｎ分泌量较Ａ组减低，Ｃ组则测不到１０ｍｉｎ分泌 量，且１ｈ分泌量也较Ａ、Ｂ两组有所减低。约下降了３０％（Ｐ＜０．０１）。各 组内比较Ａ组在４周中两个时相分泌无明显差别，Ｂ组的１０ｒａｉｎ分泌量第４
方
法
１ Ｗｉｓｔａｒ大鼠体外胰岛分离及培养和Ｂ细胞功能损伤模型的建立 采用Ｓｈｅｗａｄｅ的改良的胰岛分离方法进行Ｂ细胞原代培养，经ＤＴＺ特 异染色鉴定并待生长状态稳定后，将细胞分为三组，分别给予Ａ组５＋５ｍＭ， Ｂ组１１．１ｍＭ，Ｃ组２２．２ｒａＭ的系列糖浓度孵育，在孵育的第１，２，３，４周末， 各取一组细胞（ｎ＝４）用放免法测定在１６．７ｍＭ葡萄糖刺激后１０ｍｉｎ和ｌｈ 以及１００ｎＭ胰岛素刺激５ｒａｉｎ后的培养液上清中的胰岛素含量。用半定量
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中文论著摘要
长期高糖导致胰岛Ｂ细胞功能损伤的分子机制
目
的
葡萄糖是Ｂ细胞分泌胰岛素的刺激物，短期的高浓度葡萄糖作用可促 进Ｂ细胞的胰岛素合成与分泌。然而长期高糖作用却可导致Ｂ细胞的功 能损害。研究表明葡萄糖是通过其刺激ｐ细胞产生的胰岛素再作用于ｐ 细胞自身来上调胰岛素的合成及分泌效应的。与周围胰岛素靶组织一样Ｂ 细胞也存在胰岛素受体及胰岛素信号通路的～系列蛋白，其中与胰岛素基 因表达及分泌活动相关的主要是ＰＩ一３Ｋ信号途径。腠岛素通过ＰＩ一３Ｋ信 号途径活化ＩＤＸ一１等基因转录激活因子上调其自身的基因转录。抑制ＰＩ 一３Ｋ的活性可使ＩＤＸ一１等活性下调从而使胰岛素刺激的胰岛素基因表达 下降。推测２型糖尿病的葡萄糖毒性作用机制与减低Ｐ１３一Ｋ活性并下调 胰岛素基因转录的激活因子［ＤＸ一１的活性表达有关，最终导致胰岛素的 合成及分泌减少。本研究通过对高糖作用一定时间的Ｂ细胞的胰岛素基 因表达及分泌功能的检测来观察０细胞功能障碍的表现模式。并进一步 对功能受损的Ｂ细胞进行分子生物学检测，通过观察长期高糖作用对ＫＩ一 ３Ｋ及ＩＤＸ—ｌ活性及表达的影响来揭示高糖导致Ｂ细胞功能损伤的分子 机制。