姜黄素：一种后期转甲状腺素蛋白

姜黄素：一种后期转甲状腺素蛋白淀粉样变性的多目标疾病修饰试剂
院:生命科学学院班级：生物工程卓越314041 姓名：陈健学号：201404896 序号：02
摘要：
转甲状腺素蛋白淀粉样变性包含各种各样的获得性或遗传性疾病，它们是由有毒的转甲状腺素蛋白聚集体和纤维细胞在全身细胞外聚集所引发的，尤其是在外周神经系统。

由于转甲状腺素蛋白淀粉样变性是典型的复杂进展性疾病，同时瞄准多个分子靶的治疗方法也许会提高治疗效率和治疗结果。

在本研究中，我们评估了生理上可接受剂量的姜黄素对由体外转甲状腺素蛋白低聚物诱导产生的细胞毒素的保护效应。

这种保护是通过降低半胱天冬酶-3的活性以及结合了免疫球蛋白的内质网固定伴侣的水平实现。

拿具有家族性淀粉样多发性神经病的老年小鼠作为模型，姜黄素不仅降低了在胃肠道和背根神经节的转甲状腺素蛋白聚集体沉积和毒性，而且重塑了组织中的刚果红淀粉样物质。

此外，姜黄色通过来自年老的家族性淀粉样多发性神经病的转基因小鼠的原代巨噬细胞，增强了转甲状腺素蛋白低聚物的内化、胞内运输和降解，表明暴露在甲状腺素毒性中间体的初始吞噬细胞的活化受到了损害。

总的来说，我们的研究结果清楚地支持了，姜黄素或者经过优化了的其衍生物，对后期转甲状腺素蛋白淀粉样变性疾病是一种有潜力的多目标疾病修饰剂。

引言：
错误折叠的蛋白质作为不溶性淀粉样纤维的积累是许多神经变性疾病的重要病理特征，包括家族性淀粉样多发性神经病（FAP）、II型糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿氏病。

在这些疾病中，最后阶段在组织中积聚的物种主要由6–10 nm扭曲β褶纤组成，其中多肽链被按表排列在垂直于与氢键并行的纤维轴方向[1]。

虽然淀粉样纤维已被报道具有毒性[2]，越来越多的证据表明，非纤维状低聚物介质是神经变形的主要原因，且它可通过不同机制发挥毒性[3]。

甲状腺素运载蛋白（TTR）是一种丰富的血浆蛋白，主要由肝和脑脉络丛合成。

四聚体结构的TTR作为甲状腺激素的载体蛋白和血浆及脑脊液的视黄醇结合蛋白[4]。

细胞外的TTR 聚集和沉积引起了炎症和氧化损伤[5]、钙稳态破坏[6]、细胞外基质重塑[7]、热休克反应和内质网(ER)应激途径的激活[6,8]，包括普通分子参与者和情境，影响中枢神经系统的当地淀粉样变例如阿尔茨海默氏症和帕金森氏病，在许多特征方面类似。

FAP是一种致命的神经变性失调症，以聚集体和TTR突变形式纤维在胞外的沉积为特征，尤其发生在外周神经周围神经系统的神经中枢里。

虽然最常见的TTR突变导致FAP在30号位的缬氨酸被甲硫氨酸取代(TTR V30M)，已有超多100种的淀粉样TTR变体的描述。

TTR基因的不同类型的突变与不同的发病年龄、疾病的外显率，临床表型、预后及临床结果有关[9]。

除了家族性TTR相关的淀粉样蛋白形式，老年全身性淀粉样变性(SSA)是非遗传性，是由典型的野生型TTR淀粉样蛋白在心脏沉积而导致的较晚发病的TTR淀粉样变性，可以导致心功能不全和最终死亡[10]。

通过对化合物库的筛选和流行病学资料的组合查阅，许多低分子量有机化合物被认为是对抗淀粉样变性的有效治疗和预防试剂。

最近的研究中出现的最引人注目的方面是一些小分子，特别是天然来源的多酚，在多步淀粉样蛋白级联中，不对单一靶作用；相反，他们似乎抑制/重定向淀粉样蛋白分子动力学的不同步骤，还可以调节发生了淀粉样沉积的细胞核组织生物学[11,12]。

这在这些多酚里，姜黄素，从姜黄中分离出的一种天然来源二芳基庚酸，
被发现能够调节齐聚和几种淀粉样蛋白纤维的形成，包括TTR[12,13]、α-突触核蛋白[14]和淀粉样蛋白[15]。

姜黄素具有抗氧化和抗炎作用，被建议在各种慢性病症中发挥保护作用，例如癌症、动脉粥样硬化和神经变性疾病[16]。

此外，姜黄素能有效地螯合与淀粉样相关的金属离子，如Fe2+、Zn2+ 和Cu2+，它们可以减少体内淀粉样蛋白聚集或氧化性神经毒性[17]。

此外，姜黄素在中国和印度草药医学中作为治疗剂被广泛用，而且是美国食品和药品管理局所认定的“公认安全”。

在姜黄素被高度消耗的印度，进行的一些流行病学研究表明，这儿的阿尔茨海默病的发病率明显低于西方世界所报道的[18]。

这些现象同姜黄素在体外解体TTR淀粉样纤维[11]、激活促进淀粉样清除先天免疫系统[19]的发现一起，促使我们探讨加入姜黄素在FAP的晚期小鼠模型中的作用。

结果，姜黄素可以减少内质网应激以及在暴露于TTR聚集体的情况下，保护死亡细胞免进入凋亡信号通路。

我们将RN22细胞暴露在无或者存在一系列浓度的姜黄素中形成的TTR低聚物中，研究了姜黄素对由TTR 聚集体引起的内质网应激响应和细胞凋亡的影响。

正如由先前工作[6]所预期的那样，不具有可溶性的TTR低聚物引发了BiP在细胞内的数量明显增加，内质网应激反应的中枢调节因子[20]显示出细胞毒性(图1)。

作为强烈的对比，当相同数量的在姜黄素的存在下形成的低聚物被加入到RN22细胞时，我们并没有观测到此种效应，这表明这些物质比未经处理的低聚体介质毒性要少（图1）。

此外，将细胞单独暴露于姜黄素中(达到11 μM)并不干扰本测试中BiP在一系列使用浓度中的表达。

图1：姜黄素抑制了内质网伴侣BiP激活的TTR低聚物依耐性。

(A) 从Schwannoma细胞中提取出的抗BiP蛋白印迹，这些细胞暴露在可溶性的TTR Y78F (TTR) 中，或者是TTR Y78F低聚物(低聚物) ，或者是经姜黄素提前处理了24个小时的TTR Y78F 低聚物中（在细胞培养基中，蛋白质的最终浓度为2 μM，姜黄素为0.001–11 μM）。

同时，使用最高浓度姜黄素单独培养细胞（姜黄素11 μM）。

(B)条形图是数据的量化，以 ± SEM的平均值表示。

此外，通过在Schwann细胞株中，进行一个标准的半胱天冬酶-3检测，我们研究了TTR 聚集介质的毒性。

不同于可溶性的TTR，TTR低聚物诱导了RN22 细胞里半胱天冬酶-3极大的活性，预示了细胞的损伤以及进入细胞凋亡信号通路。

另一方面，将细胞暴露在经姜黄素处理过的低聚物中，导致了半胱天冬酶-3活性的降低有显著的剂量依赖性（图2）。

另外，当细胞单独用姜黄素(11 μM)培养时，并未观测到酶活性的显著改变（图2）。

图2：姜黄素减少了与细胞外TTR低聚物有关的半胱天冬酶-3活性
测量了Schwannoma 细胞中半胱天冬酶-3的活性，这些细胞被暴露于可溶性TTR Y78F (TTR)中，或者是TTR Y78F 低聚物(低聚物)，又或者是经姜黄素预处理（与图1中的条件一致）了24小时的TTR Y78F 低聚物中(**p < 0.01; ***p < 0.001; N.S. = non-significant)。

对姜黄素在后期FAP老鼠模型中的评价
鉴于以上所描述的具有前景的数据，以及相关的体内和体外研究的文献[12,13,21]，我们利用后期FAP 小鼠模型来代表在Hsf-1杂合子背景下的人体TTR V30M变体的淀粉样变（(hTTR V30M/Hsf）[8]，研究了姜黄素的膳食补充剂对TTR淀粉样蛋白形成的效果。

HSF-1的表达障碍导致了在数个组织内非纤维TTR沉积广泛和过早沉积，包括胃肠道及周围神经系统。

在小鼠第3到第6个月的时候，非纤维TTR 物开始累积，并逐渐演化成刚果红材料，尤其是在小鼠12个月大的时候。

因此，用于测试新的针对不同阶段的病理的治疗策略与小鼠模型是高度相关的。

在本研究中，我们旨在评估姜黄素对晚期疾病的效果，在其组织中，非纤维TTR与双折射刚果红材料并存。

方案设计、药物剂量和终点的选择是基于来自先前研究的信息[13]。

正
如预期的那样，姜黄素在老年小鼠体内的耐受性很好，并且不会产生任何可观测的副作用。

在经姜黄素处理和年龄匹配的对照组间动物间，并无观测到体重或者死亡率的改变。

此外，在用苏木精和伊红染色的肝区域里进行的形态评估中，并未观测到组织学异常（数据未展示）。

姜黄素与血浆TTR的甲状腺素结合位点结合，提高了它对解离的耐受性。

为了进一步验证姜黄素在体内与TTR结合，从被喂养富含姜黄素饮食的小鼠和标准饮食的小鼠身上，抽取血液，然后用放射性标记的甲状腺素(T4) ([125I]-T4) 培养，且在天然条件下进行凝胶电泳。

通过荧光成像分析可将标记甲状腺素结合蛋白可视化，，如补充图1中所示。

结果表明，来自经过姜黄素处理的小鼠的样品显示出可观的较少TTR带密度，表明经过肠道吸收以及分布全身之后，姜黄素选择性地和T4竞争同TTR的键合（竞争率41.74%）（补充图1）。

IEF凝胶光密度分析表明，在相同条件下，同未经处理动物身上的血浆TTR相比，姜黄素的慢性补充显著提升了TTR的耐解离性。

姜黄素减少了TTR沉积和缓解了组织毒性
血浆里TTR的水平通过放射免疫扩散来定量，在用富含姜黄素的饮食喂养的小鼠组和控制喂养的小鼠组（556.8 ± 5.1 μg TTR/ml and 556.2 ± 5.5 μg TTR/ml,分别）之间并无统计学差异，这表明添加姜黄素并不影响TTR在肝脏中的合成和在体内的周转。

通过利用SQ-IHC和蛋白印迹法检测不同靶器官，我们分析了补充姜黄素对TTR沉积和组织损伤的影响。

在治疗结束时，小鼠的平均寿命为15.5个月，正如预期的那样，控制组动物在DRG的间质结缔组织、神经元胞体周围展示出广泛的TTR沉积，并且与卫星神经胶质细胞有密切接触[8]。

作为强烈的对比，姜黄素亚慢性的添加抑制了TTR在与脊神经相关联的神经中枢里的沉积，如图3和图4所示。

在胃中也发现了相似的结果（图5和图6）。

图3：姜黄素减少了年老hTTR V30M/Hsf老鼠组的TTR的沉积和DRG里的相关毒性。

姜黄素处理的老鼠组（右图；n=12）和年龄匹配控制老鼠组(左图；n=14)的免疫组织化学分析的代表性图片，分析包括TTR、BiP、Fas死亡受体、活化半胱天冬酶-3、NF-κB、IL-1β和DRG里的TNF-α；增大40倍。

条形图：免疫化学组织图像的量化用占用面积的比例± SEM 表示(***p < 0.001)。

这些观察结果受GAPDH信号强度归一化之后的TTR水平的蛋白印迹分析的支持（图4）。

（A）姜黄素处理组(n = 6) 和控制老鼠组(n = 6)的DRG里代表性的抗BiP 和抗TTR蛋白印迹。

(B) 条形图阐明了归一化的BiP/GAPDH和TTR/GAPDH密度量化± SEM (***p < 0.001)。

在整个胃肠道里发现了相似的结果，尤其是在胃里（图5和图6）。

图5：姜黄素减少了年老hTTR V30M/Hsf老鼠组胃部的TTR聚集体沉积和相关毒性。

姜黄素处理的老鼠组（右图；n=12）和年龄匹配控制老鼠组(左图；n=14)胃部区域的免疫组织化学分析的代表性图片，分析包括TTR、BiP、MMP-9 和刚果红染色；放大20倍。

免疫化学组织图像的量化用占用面积的比例± SEM表示(***p < 0.001)。

图6：
（A）姜黄素处理组(n = 6) 和控制老鼠组(n = 6)的胃里代表性的抗BiP 和抗TTR蛋白印迹。

(B) 条形图阐明了归一化的BiP/GAPDH和TTR/GAPDH密度量化± SEM (***p < 0.001)。

由于TTR聚集体在细胞外的积累与细胞损伤和毒性密切相关[5,22]，我们接下来研究了姜黄素治疗对一些分子标记物的效果，它们与位于外周神经系统及胃肠道的疾病有关。

在DRG （图3和图4）和胃（图5和图6）中，我们发现ER伴侣BiP水平的降低。

此外，同对照组对比，在姜黄素治疗的老鼠组中我们观察到一个Fas死亡受体水平的降低（图3）。

作为以上观察现象的支撑，我们在经姜黄素处理的老鼠组的DRG里发现了一些与疾病
的发病机理相关的关键的促炎介质，即NF-κB, IL-1β 和TNF-α8。

总的说来，这些结果支持了姜黄素在胃肠道和外周神经系统对TTR沉积的调节作用。

姜黄素改变了淀粉样蛋白沉积并增强了它的清除。

已有数据表明姜黄素可在体外解体TTR纤维[12]。

这促使我们研究了姜黄素在淀粉样蛋白沉积和细胞外基质重塑的影响。

通过在胃内的刚果红染色来检测淀粉样蛋白的存在，胃是这个特殊的小鼠模型里的主要淀粉样蛋白靶器官。

结果表明14只对照动物中有7只(50%)显示出刚果红阳性材料，然而在姜黄素处理组中每12只动物只有1只(8%) 显示出刚果红淀粉样蛋白沉积（图5）。

这些结果可由在胃中MMP-9（与细胞外淀粉样蛋白沉积相关的生物标记物）水平的降低来证实（图5），因此清楚表明姜黄素在体内重塑了TTR淀粉样蛋白和细胞外基质。

姜黄素提高了巨噬细胞内TTR聚集体的内化和胞内运输
姜黄素类化合物是已知的能够提高先天免疫系统功能的物质，通过提高数个淀粉样疾病里聚集体的清除[23,24]实现。

因此，我们进一步研究了姜黄素对暴露在TTR聚集体中来自骨髓的巨噬细胞的影响。

我们通过全时点分析确认了巨噬细胞的培养纯度，通过一种特征度好以及参考广泛的成熟巨噬细胞标记物，F4/80，进行染色[25, 26]。

在对照巨噬细胞中，吸收的胞外TTR聚集体很少（图7）。

此外，TTR聚集体在胞内的传输进行得非常缓慢，这由存在于这些和EEA1 (t = 2 h, 图7)或者LAMP-1 (t = 24 h,图.7)之间的限制性共定位有关。

图7：FPA老鼠 (hTTR V30M/Hsf mice)的经姜黄素处理的巨噬细胞显示出增加的TTR聚集体的内化和降解。

双免疫荧光标记TTR的代表性图片，包括TTR（绿色）和EEA1（红色）、TTR（绿色）和F4／80（红色）或TTR（绿色）和LAMP-1（红色），显示在姜黄素处理的老鼠组（箭头）中，TTR胞内聚集体同内涵体和溶酶体的共定位。

标签的叠加以及DAPI (蓝色)被放大63倍来显示。

所呈现的数据代表三个相互独立的实验。

在将TTR聚集体加入到细胞培养基之前，经过处理的巨噬细胞被重新暴露于姜黄素中，且通过双免疫荧光共聚焦显微镜，我们发现了经姜黄素预处理的巨噬细胞导致了TTR胞外聚集体的迅速内化和溶酶体降解，从TTR低聚物分别和EEA1 (t = 2 h,图7) or LAMP-1 (t = 24 h,图7)的共定位可知。

巨噬细胞暴露在姜黄素治疗前的竞技场队伍聚集细胞培养基。

用共焦显微镜,我们发现姜黄素刺激导致快速的竞技场队伍总量的内化和溶酶体降解如图所示通过共定位EEA1(t = 2 h,图7)和LAMP-1(t = 24小时,图7),分别的最佳剂量姜黄素(1μM)确定使用范围广泛的浓度(0.01 -100μM)。

浓度高于1μM没有增加骨料由巨噬细胞内化。

讨论
淀粉样蛋白级联的工作假说,支持广泛的工作和文学,导致认为稳定原生竞技场队伍结构可能是一个有前途的治疗方法停止生产有毒物种淀粉样蛋白队伍。

自从FAP和其他
TTR-related淀粉样变性是进步的和复杂的多系统疾病,治疗策略的目标同时多个分子靶点,通过联合疗法或多靶向化合物,可以提高治疗疗效和治疗结果。

姜黄素具有对称和延长共轭分子结构,类似于刚果红的结构,检测淀粉样蛋白沉积物21
经典的黄金标准。

此外,姜黄素能够有效地穿过血脑屏障,这是一个重要的功能目标治疗淀粉样蛋白沉积在中枢神经系统27,28。

从我们组关于竞技场队伍淀粉样变,以前的工作表明,在体外,姜黄素绑定基本上空置的甲状腺素结合口袋的本机竞技场队伍结构提高其抵抗非单体聚合成有毒总量12离解。

最近,之间形成复杂的晶体结构和姜黄素竞技场队伍已经确定,这印证了我们的初步结果表明,完整的姜黄素结合两T4结合位点位于四聚物中央通道29竞技场队伍。

在目前的研究中,我们调查的影响姜黄素补充在晚期FAP的小鼠模型。

肠道吸收和系统性分布后,姜黄素选择性与在等离子体,在很大程度上未被T4捆绑进口袋,增加竞技场队伍稳定。

除此之外,姜黄素大幅降低纤维状的沉积在组织和毒性,尤其是胃肠道。

这些结果证实了之前的研究早期FAP 老鼠13并按照工作假说为淀粉样变的竞技场队伍稳定原生竞技场队伍褶皱小分子聚合和毒性将阻止蛋白质。

此外,胃部分刚果红双折射分析后,我们发现,姜黄素治疗小鼠的效果呈现明显越来越小。

相比控制老鼠，这些结果支持大幅削减MMP-9的水平在治疗小鼠和清楚地表明,姜黄素促进淀粉样蛋白重构,再吸收,细胞外基质复苏。

我们的观察证实为其他淀粉样变性，由获得的结果看。

例如：饮食姜黄素在小鼠模型的广告管理导致标签Aβ斑块,减少淀粉样蛋白水平和斑块。

虽然我们的数据表明,姜黄素调节的级联与聚合中间体直接交互,我们推测分子目标的多样化姜黄素是否会加强其神经保护作用和改善治疗结果体内。

例如,因为高浓度的Zn2 +和Cu2 +可以引发淀粉样变性；似乎合理的推测姜黄素是否知道与这些ions17might形成复合物的能力有助于抑制异常的聚合和体内毒性竞技场队伍。

此外,令人信服的证据表明,姜黄素能够通过多种信号小路抑制炎症。

因此,减少炎性反应在DRG沉积,观察姜黄素对小鼠的作用,可能是不仅由于姜黄素淀粉样蛋白效应,而且其著名的块的生产能力关键炎症介质如NF-kB TNF-α或IL-1β33。

然而,姜黄素被认为主要是作为一种抗氧化剂。

按照最近的一项研究由议长奥卡等透露,这是非常低剂量的姜黄素主要的效果(低于1μM)在较高的浓度,10μM,它开始诱导自噬和更高剂量的早期(> 25μM)凋亡和内质网应激引起钙释放,线粒体间的不稳定和促进肿瘤细胞死亡。

这种激效姜黄素的特点详细使用肿瘤细胞行即肝癌Huh-7 cells38。

然而,分子姜黄素对复杂的细胞系统的影响可能最有可能特异性浓度和时间的方式。

自噬缺陷的机械或线粒体动力学可能发挥病理作用，使神经退行性无秩序，AP也可能受损。

事实上,它是最近研究出来的，姜黄素能够减少单体的竞技抗性,通过促进LC3乳沟,从而提高自噬细胞培养系统。

重要的是,Hsf-1小鼠的研究表明,Hsf-1might调节自噬活动42扮演一个角色。

因此,未来的研究披露自噬的作用在FAP还应该包括其他动物模型的使用。

转体基因野生型或突变,可以通过不同类型的细胞内化,包括肝细胞、小鼠胚胎成纤维细胞,卵黄囊细胞,感觉神经元和神经胶质细胞。

从三角和他的同事们最近的研究表明,成纤维细胞细胞内含物和降低聚合体外和vivo47竞技场队伍。

一起这些研究提供证据的复杂细胞动力学基本分解代谢和间隙和竞技场队伍在FAP病理学的影响。

我们推测,细胞损伤的一个或多个这些机制可能形成淀粉样蛋白/降解平衡转向致病性竞技场队伍总积累在细胞外基质。

此外,总量内化也可能有害的细胞导致死亡和器官功能障碍,这一个主题,需要进一步调查。

在过去几年,相当多的关注已经给免疫系统起到了治疗淀粉样疾病的作用。

巨噬细胞和小胶质细胞的先天免疫细胞负责清除病原体和废物。

姜黄素类化合物已报告来增强吞噬的Aβ上调1的转录,4-] 甘露糖-糖蛋白l 4-β-N——] 葡萄糖胺乙酰转移酶和其他基因,通常包括toll样受体,抑制在疾病单核细胞。

同样地,我们发现找出的巨噬细胞与hTTR V30M / Hsf老鼠,生理上可实现的剂量姜黄素(1 - 10μM),提高了吞噬吸收和降解细胞外的淀粉样蛋白聚集而竞技场队伍控制巨噬细胞(暴露于车辆)。

因此,我们的观察表明,年龄在FAP巨噬细胞吞噬能力不足,建议可能损害他们的功能。

事实上,它已经从FAP患者先前表明,神经活检没有显示先天细胞渗入周围的淀粉样蛋白沉积,应该预测巨噬细胞密度表达下调在FAP刺激后小鼠的模型。

尽管巨噬细胞清除损伤分子机制大多是未知的,目前的研究显示,慢性管理姜黄素可以调节细胞外积累的先天免疫系统响应并提供一个竞技场队伍FAP以前无特征的方法来治疗。

未来的研究将进一步解决在FAP巨噬细胞病理学的角色使用不同的FAP鼠标线在竞技场队伍淀粉样蛋白形成的不同阶段。

目前,各种各样的新兴疾病修饰剂在人类临床实验下，正在分析中。

从竞技场队伍稳定剂，如二氟尼柳，氯苯唑酸,基因疗法抑制表达竞技场队伍(siRNAs)和淀粉样原纤维干扰(强力霉素/ TUDCA),有效治疗淀粉样变性竞技场队伍的观点似乎鼓励现在比以往任何时候都多。

尽管如此,仍有许多未知的关于这种方法的长期安全性和有效性,除了强力霉素/ TUDCA疗法,他们中的大多数只针对疾病的早期阶段。

我们的研究结果表明,姜黄素作为晚期竞技场队伍淀粉样变的有趣的化合物。

考虑其多能性、耐受性高,长期使用,和廉价的成本,我们推测其联合政府可用它的治疗可能提高治疗效果和结果先进的淀粉样变。

总之,目前的研究表明,姜黄素抑制聚合竞技场队伍以剂量依赖的方式,提高骨料竞技场队伍由体外巨噬细胞间隙。

当管理FAP老鼠,姜黄素不仅减少负担和姜黄素化合物毒性,也重新塑造材料组织。

总的来说,我们的研究结果清楚地支持姜黄素或优化衍生品作为晚期有前途的多目标疾病修饰剂修饰淀粉样变。

材料和方法
姜黄素
姜黄素是从Sigma-Aldrich购买,圣路易斯,密苏里州,美国。

姜黄素纯度≥80%(高效液相色谱),总姜黄素类化合物纯度≥94%(高效液相色谱)。

生产重组变异姜黄素化合物
重组V30M和Y78F生产、隔离和净化进行了如前所描述的来制备荧光寡聚物，0.2可溶性V30M竞技场队伍在PBS透过μm Anotop注射器过滤器(英国绘画纸)与荧光染料标记Alexa 萤石488(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。

姜黄素化合物总量被孵化生成蛋白质(2毫克/毫升),搅拌,在室温下7 days6。

准备分析动态光散射(DLS)25°C莫尔文Zetasizer Nano z(莫尔文,伍斯特,英国)之前报道,确认致病aggregation11竞技场队伍。

细胞培养实验评估ER应激和凋亡
可溶性溶解在姜黄素化合物2毫克/毫升PBS和姜黄素股票准备在二甲亚砜(DMSO)。

可溶性竞技场队伍是混合了不同浓度的姜黄素(0.02 -200μM)或溶剂单独(DMSO)。

样品只包含200年姜黄素μM也准备。

所有样品都保存在琥珀埃普多夫管(光保护)和培养6天在37°C允许聚合。

这些样品被稀释(18×)在细胞培养基获得浓度为2μM竞技场队伍和提高姜黄素的浓度-11 - 0.001μM不等。

之后,这些样本添加到如下描述的细胞。

老鼠的神经鞘瘤细胞(RN22)(美国类型细胞集合)previously11描述传播和维护。

短暂,80%汇合的细胞在杜尔贝科的最小基本培养基(DMEM)补充1%胎牛血清暴露,(二)2μM刚做好的可溶性姜黄素化合物,和上面的稀释样品准备,即iii) Y78F寡聚物或iv)curcumin-induced姜黄素的寡聚物或v)11μM姜黄素化合物。

治疗后,细胞使胰蛋白酶化和细胞溶解使用含有5毫米的冰冷的裂解缓冲乙二胺四乙酸、2毫米乙二醇四乙酸、3 - 20毫米(N-吗啉代)丙烷磺酸,特里同x - 100 1%,1毫米苯基甲烷磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合(通用电气医疗集团)。

细胞溶解产物被用于毕普测定细胞内水平和caspase-3活动。

蛋白质浓度溶解产物决定使用Bio-Rad蛋白质化验设备。

Caspase-3访问活动使用CaspACE荧光的96孔板检测系统(σ-奥尔德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。

测定毕普水平通过免疫印迹分析等量的蛋白质溶解产物分离在15% sds - page和转移到一个硝基Hybond-C膜(Amersham生物科学)使用半干系统。

主要的抗体和相应的稀释使用:兔多克隆anti-BiP(1:1000)和小鼠单克隆
anti-GAPDH(1:3000)(Abcam,剑桥,英国)。

检测与执行TM高潮(增强化学发光微孔,。

量化的墨。