相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
最新荧光定量PCR原理及操作规范
如有加样则应在超净台内进行。
打开反应管前快速离心数秒。
PCR实验室污染及对策
污染源 1.标本间的交叉污染。 2.实验室中克隆质粒的污染。 3.PCR产物的污染。
PCR实验室污染及对策
污染处理方法 1.通风 2.次氯酸钠 3.紫外照射
课后思考：紫外照射消除污染的原理？
荧光PCR的光学原理
定量PCR仪日常维护
PCR实验室的规范化设置
试剂准备间 功能： 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 注意事项： 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
实验室及其设备的使用必须有日常记录。
样本处理间 功能： 临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和 测定RNA时cDNA的合成。 注意事项： 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。
什么是荧光定量PCR？
荧光定量PCR是指在PCR反应体系中引入荧光基 团，利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程，最 后通过标ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方 法。
荧光PCR的化学原理
定量PCR的数学原理
荧光PCR信号方程
CT值由阈值确定
Threshold（阈值）
CT
CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。
用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
案例三：病原体检测
总结词
荧光定量PCR在病原体检测中具有高灵敏度和特异性，能够快速准确地检测出极低浓度 的病原体。
详细描述
针对病原体特异性基因序列设计引物和探针，通过荧光定量PCR技术对临床样本进行扩 增和检测。这种方法在传染病诊断、食品安全检测等领域具有广泛应用，能够为疾病预
防和控制提供有力支持。
模板制备
将提取的DNA进行浓度测 定和调整，确保其浓度符 合荧光定量PCR的要求。
引物设计与合成
根据目标基因序列，设计 特异性引物，并进行合成 。
荧光定量PCR反应
反应体系配置
将PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、引 物、DNA模板等按照比例加入PCR管 中。
循环参数设置
荧光信号检测
在PCR仪中进行荧光信号的实时检测 ，记录荧光信号的强度和循环数。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR应用指南
荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、灵敏、特异性强的PCR技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
在qPCR中，荧光信号与PCR 产物的数量成正比，因此可以通过荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
qPCR有两种常见的方法：两步法和三步法。
两步法是最常用的qPCR方法之一。
在两步法中，反应分为两个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
两步法的优点是简单易行，适用于大多数qPCR应用。
但是，两步法需要使用反转录酶来合成cDNA，这可能会引入反转录酶的偏差和不确定性。
三步法是另一种qPCR方法，它将反应分为三个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是前置扩增，使用特定的引物对目标序列进行前置扩增；第三步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
三步法的优点是可以减少反转录酶的偏差和不确定性，提高PCR的特异性和灵敏度。
但是，三步法需要进行前置扩增，增加了实验的复杂性和成本。
无论是两步法还是三步法，qPCR都是一种非常有用的技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
qPCR在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用，例如检测病原体、基因表达分析、环境污染监测等。
随着技术的不断发展，qPCR将会在更多的领域得到应用，
并为科学研究和临床诊断提供更加精确和可靠的数据。
荧光定量PCR技术的使用教程
荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。
荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。
第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。
2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。
应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。
3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。
4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。
6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。
7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。
8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。
第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。
2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。
第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。
2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。
- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。
三种荧光定量PCR检测方式比较精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版三种荧光定量PCR检测方式比较：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一样是在PCR扩增的指数期进行的。
常见检测方式可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，能够依照荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一样为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只若是双链就会结合发光，对PCR 反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，因此在临床上利用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优势：SYBR Green I 的优势是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，因此对不同模板不需专门定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。
这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。
(2) 水解探针模式(man探针)TaqMan 探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5’结尾，而淬灭剂那么在3’结尾。
当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反映时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。
一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积存。
因此Taqman 探针检测的是积存荧光。
PCR 扩增程序一般是：94℃～60 ℃40 个循环。
经常使用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
定量PCR的实验流程及注意事项
定量PCR的实验流程及注意事项一、实验流程：1. Primer设计：为了进行定量PCR实验，需要设计一对与目标DNA 或RNA序列特异性结合的引物。
确保引物的特异性和互补性，通过使引物的浓度相等可以最大限度地提高PCR反应的扩增效率。
2.模板DNA或RNA提取：从细胞或组织中提取目标DNA或RNA。
可以使用商业化的DNA/RNA提取试剂盒或其他方法进行提取。
注意保持样品的完整性，避免污染和降解。
3.RNA逆转录（如果需要）：如果目标是RNA，则需要使用反转录酶将mRNA转换为cDNA。
通常，使用逆转录酶和随机引物进行逆转录反应。
4. qPCR反应体系：准备PCR反应体系，其中包含引物、模板DNA或cDNA、酶（如Taq DNA聚合酶、逆转录酶等）和反应缓冲溶液。
同时还可以加入SYBR Green等荧光染料或探针以实现实时监测PCR反应的进行。
5.PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，如温度和时间等。
通常情况下，PCR反应会进行多个循环，每个循环包括退火、延伸和变性三个步骤。
6.实时检测PCR反应：在PCR反应过程中，使用实时荧光检测系统实时监测PCR产物的积累。
根据荧光信号变化的阈值周期数（Ct值），可以推断出目标DNA或RNA的初始浓度。
7.标准曲线构建：通过使用已知浓度的目标DNA或RNA来构建标准曲线。
将标准曲线与待测样品的Ct值进行比较，可以计算出目标物浓度。
8.数据分析：根据标准曲线和待测样品的Ct值，计算出目标物的相对或绝对浓度。
可以使用专业的数据分析软件对实验结果进行统计分析和解释。
二、注意事项：1.特异性引物设计：确保引物与目标DNA或RNA的特异性结合，避免引物与非目标序列的扩增。
2.制备PCR反应的质量控制：采用无菌、无核酸污染的试剂和实验环境，避免引入杂质干扰PCR反应。
3.避免PCR反应产物的污染：使用专门用品和设备进行PCR实验，避免引入外源性DNA或RNA。
4.逆转录反应的标准化：如果进行RNA定量PCR，应尽量标准化逆转录反应的条件，以获得准确的cDNA模板。
相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项
相对荧光定量PCR三种常⽤⽅法、注意事项相对定量⽅法实际操作（三种常⽤⽅法）本⼈⽤的是相对荧光定量PCR法，在分⼦⽔平上⽐较课题中5种新基因的表达差异。
实验进⾏很多次，感受颇深，同时遇到了⼀些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同⾏朋友⼀起探讨和指教。
1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）1).先对样品中的⽬的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否⼀致或接近；将扩增效率优化为⼀致。
2).同⼀样品分别进⾏看家基因和⽬的基因的扩增，分列在两页中公式：P1 P2相同的样品在两页⾥命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填⼊，并定义对照样品完成分析F=2—待检样品看对照组⽬的基因平均Ct对照组看家—待检样品⽬——Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应⽤1). Comparative Delta-delta Ct法是很常⽤的⼀种相对定量⽅法，其最⼤特点是，当优化的体系已经建⽴后，在每次实验中⽆需再对看家基因和⽬的基因做标准曲线，⽽只需对待测样品分别进⾏PCR扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认⽬的基因和看家基因的扩增效率⼀致，⽽并⾮真实扩增情况的反映，这⾥势必存在⼀定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对⽬的基因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会⾃动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差⼩于0.1，那么后续实验中就可以⽤Comparative Delta-delta Ct法进⾏相对定量分析。
反之，如果M差值⼤于0.1，就⽆法⽤该⽅法进⾏相对定量分析。
此时的解决⽅法有两种，⼀是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值⼩于0.1，⼆是换⽤其它的相对定量⽅法。
荧光定量PCR实验技术干货
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相对定量分析－－管家基因筛选
• 管家基因
– 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，
– 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
• 筛选方法
– 根据文献提供 – 通过具体实验筛选
实验值
6 5 4
Pβ-Actin PGAPDH
3 2 1
Oβ-2-microglobulin PHPRT
荧光定量PCR原理－－Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
➢ Ct值的特点： • 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； • Ct值极具重现性
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荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理 理想的PCR反应 Xn＝X0 * 2n
n：扩增循环数 X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
• 方法：检测毕赤酵母的A基因 • 标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照 • 实验步骤：
提取A DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。
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绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量
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绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量
➢ 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
Sample
2 5
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绝对定量分析几要素
• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 • 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒
、PCR产物、基因组DNA等。 • 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统
荧光定量PCR注意事项
荧光定量PCR注意事项
A、在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。
B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污染。
C、操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。
每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。
D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。
E、荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。
F、配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。
G、配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。
荧光定量pcr仪使用注意事项
荧光定量pcr仪使用注意事项一、实验前的准备工作1. 样品准备：确保样品的质量和纯度，避免有杂质或受到污染。
同时，根据实验需要适当稀释样品，以避免过高的浓度对荧光定量PCR反应的影响。
2. 引物设计：合理设计引物序列，确保引物的特异性和互补性，避免引物间的二聚体或非特异性扩增。
3. 反应体系的准备：根据实验需要准备好反应体系，包括引物、模板DNA、荧光标记的探针和PCR反应缓冲液等。
4. 试剂储存：保持试剂的干燥和防止受到光照。
一些试剂需要在低温下储存，如荧光标记的探针和酶。
二、操作过程中的注意事项1. 操作环境：在PCR实验室内进行操作，确保无尘、无菌、无DNase的环境。
避免空气中存在的DNA污染样品。
2. 试剂配制：根据实验要求准确配制试剂，避免试剂过量或不足对实验结果造成影响。
3. 反应体系的设置：根据实验需要合理设置反应体系，包括反应体积、荧光标记的探针的浓度和引物的浓度等。
4. 荧光定量PCR仪的设置：根据实验需要设置PCR仪的温度、时间和周期数等参数。
确保PCR过程中的温度和时间的准确性和稳定性。
5. 试管或板的选择：根据实验需要选择合适的试管或板，确保样品和试剂能够均匀混合和扩增。
6. 试管或板的密封：在PCR反应过程中，确保试管或板的密封性良好，避免反应液的蒸发和外界污染的影响。
三、仪器的维护保养1. 清洁仪器：定期清洁PCR仪的工作台面、加热盖和仪器外壳，避免灰尘或油污对实验结果的影响。
2. 更换滤芯：定期更换PCR仪的滤芯，避免污染源对仪器和实验结果的影响。
3. 定期校准：定期校准PCR仪的温度和时间等参数，确保仪器的准确性和稳定性。
4. 仪器的存放：在不使用PCR仪时，将仪器存放在干燥、无尘和适宜的温度环境中，避免受潮或过热对仪器的影响。
5. 仪器的保养：定期对PCR仪进行保养，包括清洁、更换耗材和维修等，确保仪器的正常运行。
总结：使用荧光定量PCR仪需要在实验前做好准备工作，包括样品准备、引物设计、反应体系的准备和试剂储存等。
pcr应用中确认RNA的质量常用的三种方法
pcr应用中确认RNA的质量常用的三种方法实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。
RNA样本提取的质量直接影响基因表达分析。
影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。
检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：紫外分光光度计法：测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。
需要注意的是：在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。
260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1之间。
＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA 可能发生降解。
琼脂糖凝胶电泳：完整的RNA通常有三条带，最亮的是28S条带，其次是18S条带，最淡的是5S条带（部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带）。
通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。
该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。
如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量好。
若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。
上述两种方法在实验室比较常用，此外还有几种检测方式供大家选择。
荧光染料检测：通过荧光染料和RNA结合，荧光活性增强。
此方法的灵敏度较高，主要用于检测RNA的浓度。
微毛细管电泳：可使用软件的RIN（RNA Integrity Number）分数评估，10为RNA完整性好，0为最差。
此方法的灵敏度和分辨率较高，可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。
3’-5’完整性检测：是在一个RNA样本中检测GAPDH mRNA的完整性来代表所有RNA的完整性，主要用于检测RNA 的完整性。
得到高品质RNA的小建议：1、尽量避免RNA酶污染，使用无RNA酶的耗材和试剂，建议将扩增前后的场所分开。
2、尽量减少采样时间，样品处理后快速冷冻，可以加入RNA保护剂。
3、RNA提取过程中可以使用RNA酶抑制剂。
荧光定量PCR实验中的策略及注意事项
荧光定量PCR实验中的策略及注意事项荧光定量PCR实验中的策略及注意事项前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。
考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR 实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别？简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR 片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。
如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。
近两年没有人再讲这类的话了。
Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。
对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。
它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。
下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。
一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。
1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。
2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。
4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。
二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。
将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。
2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。
一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。
3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。
4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。
仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。
5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。
通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。
荧光定量PCR原理及操作步骤课件
数据分析与解释
根据数据绘制标准曲线、计算基因表 达量、比较不同样本之间的差异等。 对结果进行解释，并得出结论。
03
荧光定量PCR实验注意事 项
实验安全注意事项
01
02
03
04
实验操作人员必须经过专业培 训，熟悉实验原理、操作步骤
及安全防护措施。
实验过程中需佩戴个人防护用 品，如实验服、一次性手套、
在生物学领域，它可以用于基因表达研 究、基因组学和蛋白质组学研究、进化 生物学和生态学研究等。
02
荧光定量PCR实验操作步 骤
实验准备
仪器与试剂准备
确保PCR仪、离心机、移液器等 设备正常运行，准备好PCR反应 所需的各种试剂，如引物、探针 、dNTPs、Taq酶等。
实验设计
根据实验目的和样本类型，选择 合适的引物和探针，并设计合理 的PCR反应程序。
荧光定量PCR的应用
荧光定量PCR在医学、生物学、农业和 环境科学等领域有广泛的应用。
在环境科学领域，它可以用于环境微生 物学研究、污染物检测和生态毒理学研 究等。
在农业领域，它可以用于转基因作物检 测、动物疫病检测和食品安全检测等。
在医学领域，它可以用于病原体检测、 基因表达分析、突变检测和耐药性分析 等。
口罩等。
实验区域应保持清洁，避免交 叉污染。
荧光定量PCR实验中使用的试 剂和仪器应符合相关安全规定
。
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读试剂盒说明书，了 解实验操作步骤和注意事项。
荧光定量PCR仪器的使用应遵循仪器 操作手册，确保仪器正常运行和实验 结果的准确性。
实验操作应严格按照试剂盒说明书进 行，避免操作失误导致实验结果不准 确。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法1 荧光定量PCR简介荧光定量PCR是一种检测DNA样本中特定目标序列数量的方法，它结合了聚合酶链式反应（PCR）技术和荧光探针的使用。
相对于传统PCR技术，荧光定量PCR能够给出更加准确的目标序列数量结果，并且可以在一个反应管中同时检测多个目标序列。
荧光定量PCR分为两步法（Two-Step qPCR）和三步法（Three-Step qPCR），它们的反应机理有所区别，适用于不同的实验需求。
2 两步法2.1 反应机理两步法荧光定量PCR，又称为逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR），是通过逆转录将RNA转化为cDNA，再将cDNA参与PCR反应，并通过荧光探针实时监测反应过程中目标序列数量变化的方法来定量RNA的表达水平。
具体过程：先用一个专门的逆转录酶II将RNA转化为cDNA，然后将cDNA加入到PCR反应中，PCR反应过程中，荧光探针会与目标序列结合并荧光发射，PCR反应的进程中，荧光探针完全分解之前，荧光信号增强，通过分子探测器检测荧光信号的数量，即可以得到目标序列的数量。
2.2 应用场景两步法荧光定量PCR通常被用于研究转录调控、RNA可变剪接的研究，以及疾病诊断中的病原体检测，包括HIV、乙肝病毒、H1N1流感病毒等等。
3 三步法3.1 反应机理三步法荧光定量PCR，又称为普通荧光定量PCR或SYBR-green染料荧光定量PCR，是利用SYBR-green染料的荧光信号实时监测PCR反应过程中DNA目标序列数量变化的方法来定量DNA的含量。
具体过程：PCR反应体系中加入SYBR-green染料，在PCR反应过程中，荧光信号随着PCR扩增产物的增加而增大，通过检测荧光强度的变化，可以计算出PCR扩增产物的数量。
3.2 应用场景三步法荧光定量PCR通常被用于基因表达、基因定量、基因型鉴定以及SNP分析等实验中。
4 两步法和三步法的区别两步法和三步法的主要区别在于荧光信号的来源不同。
荧光定量pcr数据处理
荧光定量pcr数据处理荧光定量PCR数据处理一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，用于定量检测特定DNA序列的存在和数量。
在荧光定量PCR实验中，通过引物与DNA靶标的特异性结合，经过一系列的扩增步骤，最终通过荧光信号的强度来判断靶标DNA的存在和含量。
本文将介绍荧光定量PCR数据处理的相关内容。
二、荧光定量PCR数据的基本处理流程荧光定量PCR数据的处理包括以下几个主要步骤：1. 荧光曲线绘制：将实验得到的荧光信号强度与PCR循环数进行绘图，得到荧光曲线图。
荧光曲线图通常呈指数增长的形式，其中荧光信号强度与PCR循环数成正比。
2. 阈值确定：在荧光曲线图中，需要确定一个合适的阈值来判断荧光信号的阴性和阳性。
阈值通常选取在指数增长期的线性段上，使得荧光信号在此段内明显高于背景噪音。
3. CT值计算：CT值（Cycle Threshold）是指荧光曲线与阈值相交的PCR循环数。
CT值反映了样品中目标DNA的含量，通常CT值越低，目标DNA含量越高。
4. 标准曲线绘制：使用已知浓度的标准品进行荧光定量PCR实验，绘制标准曲线。
标准曲线可用于计算未知样品的目标DNA浓度。
5. 目标DNA浓度计算：通过比较未知样品的CT值与标准曲线上对应CT值，可以计算出目标DNA的浓度。
三、荧光定量PCR数据处理注意事项在进行荧光定量PCR数据处理时，需要注意以下几点：1. 样品质量控制：样品的质量对荧光定量PCR结果影响较大。
因此，在样品处理过程中需注意避免污染和降解，以保证实验结果的准确性。
2. 阈值的选择：阈值的选择对结果的准确性和可比性至关重要。
过高或过低的阈值可能导致结果的偏差，因此应根据具体实验情况选择合适的阈值。
3. CT值的解释：CT值不仅与目标DNA的含量有关，还与扩增效率和实验条件等因素有关。
因此，在比较不同样品的CT值时，需注意考虑这些因素的影响。
荧光定量pcr标准曲线
荧光定量pcr标准曲线荧光定量PCR（qPCR）是一种用于测定DNA或RNA含量的高灵敏度技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定等领域。
在进行荧光定量PCR实验时，构建标准曲线是非常重要的一步，它可以帮助我们准确测定待测样本中的目标基因含量。
本文将介绍荧光定量PCR标准曲线的构建方法及相关注意事项。
1. 标准曲线构建方法。
在构建荧光定量PCR标准曲线时，首先需要选择适当的内参基因或外源标准品作为模板，通过稀释系列浓度来构建标准曲线。
在进行PCR扩增反应后，利用荧光定量PCR仪器检测不同模板浓度对应的荧光信号强度，并绘制荧光强度与模板浓度的标准曲线图。
通常情况下，我们会选择5-6个不同浓度的模板进行扩增，以确保标准曲线的可靠性和稳定性。
2. 注意事项。
在构建荧光定量PCR标准曲线时，需要注意以下几点：（1）选择合适的内参基因或外源标准品，确保其在待测样本中不受到影响，并且具有稳定的表达水平。
（2）稀释系列浓度要合理，通常建议选择1:10的倍数进行稀释，以确保标准曲线的线性范围覆盖待测样本的目标浓度范围。
（3）在进行PCR扩增反应时，需要严格控制反应条件，确保不同浓度模板的扩增效率一致，避免扩增偏差对标准曲线的影响。
（4）在检测荧光信号强度时，要选择合适的荧光通道，确保能够准确检测到目标信号，避免干扰信号对结果的影响。
（5）绘制标准曲线图时，要选择合适的曲线拟合模型，确保曲线拟合的稳定性和准确性。
3. 应用示例。
以某基因的荧光定量PCR标准曲线构建为例，我们选择了内参基因作为模板，通过稀释系列浓度，得到了不同浓度模板对应的荧光信号强度。
通过绘制标准曲线图，我们发现在一定浓度范围内，荧光信号强度与模板浓度呈现出良好的线性关系，R²值达到0.99，表明标准曲线的拟合效果良好。
在实际应用中，我们可以利用该标准曲线对待测样本进行定量检测，准确测定目标基因的含量。
4. 结语。
荧光定量PCR标准曲线的构建是荧光定量PCR实验中的关键步骤，正确的构建方法和严格的操作流程可以保证标准曲线的准确性和稳定性，为后续实验结果的可靠性提供保障。
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相对定量方法实际操作
（三种常用方法）
本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。
实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。
1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置）
1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个
基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。
2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中
公式：
P1 P2
F=2—
待检样品看
家基因平均
Ct值
对照组目的
基因平均Ct
值
对照组看家
基因平均Ct
值
—
待检样品目
的基因平均
Ct值
——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用
1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点
是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真
实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。
3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基
因和看家基因做两组标准曲线。
Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于
0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量
分析。
反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。
此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
应用实例：
如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。
软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。
从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值<0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct 法两进行相对定量。
在完成上述预实验之后，接下来就可以正式对待测样品进行定量分析。
在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增，下图即为一个标准的扩增分析结果：
为进行Comparative Delta-delta Ct分析，需要对样品进行一些编辑。
简而言之，即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。
在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家基因，10-18号管检测了目的基因。
可通过NEW新建一个page，并通过Selected选择每页中分析的对像。
将两组基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下图所示：
Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES 选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。
Page 1：看家基因，其中1-9号管通过YES 选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。
样品编辑好后就可进行分析工作。
通过进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。
注意：由于没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖
动光标即可。
完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT分析界面，选择show，此时，软件的向导界面会提示使用者一步步完成设置：
由上至下，依次完成各项设置。
第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。
选择Yes；
第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页；
第三项：Normaliser Quantitation ，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的
那一页；
第四项：Calibrator Defined ，选中A 、B 、C 三个样品中用来作为对照组的一个。
完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：
结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT 值，以及样品B 、C 中目的基因的浓度相对于对照组A 的比值。
2. 双标准曲线法定量流程（RG6000软件设置）
1). 用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准
曲线，必需有一组稳定的标准品。
2). 同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页
上。
P1 P2
稳定的梯度稀释标准品：梯度稀释的含目的基因的质粒或PCR 产物，并设类型为Standard ，给出浓度
待检测样品：扩增目的基因unknown 同一待测样品命名同一名称，并设类型为unknown
稳定的标准品：梯度稀释的含看家基因的质粒或PCR 产物，并设类型为Standard ，给出浓度
待检测样品：扩增看家基因unknown
公式：
（基因的浓度由软件根据标准曲线直接给出）
双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用
1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta
CT 法那样对实验进行严格的优化。
2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
3. 并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化
的PCR 产物，而待测样品为cDNA ，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。
应用实例：
在该实验中，样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A 、B 、C ，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。
分别分析P1和P2页
选Two Standard Curve 选项
依次填入，并定义对照样品
完成分析
待测样品看家基因浓度 对照组目的基因浓度 对照组看家基因浓度
F= 待测样品目的基因浓度
在用双标准曲线法做相对定量之前，同样需要对样品进行一些编辑。
方法与Delta-delta CT法类似，即将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。
编辑完成之后即得：
样品编辑好后就可进行分析工作。
进入Analysis ，分别对page1和page2进行分析。
完成分析之后，从Other 进入，选择2 Standard Curves Relative Quantitation 。
根据提示向导依次完成设置。
依次选中目的基因的page 、看家基因
的page 以及对照组（例，以A 为对照组），如图：
结果包括计算所得的各标准品及待测样品的浓度及CT 值，以及样品B 、C 的目的基因相对于对照组A 的浓度。
3. Comparative Quantitation 法定量流程（RG6000软件设置）
Page 1：看家基因，其中7-12号管为标准曲线，通过YES 选中，15-17号管为待测样品，分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可不以不进行编辑。
Page 2：目的基因，其中1-6号管为标
准曲线，通过YES 选中，18-20号管为待测样品，分别命名为A 、B 、C ，其它未选中的样品可不以不进行编辑。
1). 该方法并不常用，因为必需确定起始样品的总核酸浓度一致。
在芯片验
证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。
2). 作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。
3). 该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。
4). 该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。
使用时，样品均定
义为unknown，分析时选用Comparative Quantitation，确定对照组，
完成分析。
应用实例：
用Comparative Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C，扩增目的基因。
进入Analysis，在Other中选择Comparative Quantitation。
选中后点击Show即给出分析结果。
上图左下方即相对表达量的结果，其中Rep.Conc为样品B、C相对于对照组A 的目的基因浓度。
右侧，可通过修改Calibrator Replicate改变对照组，以获得不同的比较结果。
在Report中同样给出拐点图和相对定量的比值结果：。