第三章 蛋白质及酶工程
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第三章
蛋白质及酶工程
本章主要内容：
第一节 概述 第二节 基因诱变技术 第三节 蛋白质的改造
第一节 概述
• 2.1.1 蛋白质基础
蛋白质的一级结构 ：是以肽键为主键或有
少量二硫键为副键的多肽链，显示氨基酸 种类和顺序的线性分子
蛋白质的二级结构：这是在一级结构的基
础上，借氢键在相邻两氨基酸残基之间的 引力使分子结构发生折曲的结构 α -螺旋（α - helix) β -折叠(β -pleated sheet)
蛋白质的三级结构：在二级结构的基础上由
氨基酸残基侧链相互作用而使多肽链 进一步盘旋折叠形成特定的三维构 象。参与维系结构的有氢键、离子 键、疏水键等。
蛋白质的四级结构：由两条或两条
以上多肽链组成的蛋白质，每个独立肽 链的三级结构称为亚单位，几个亚单位 之间通过氢键等化学键引力相互作 用形成更为复杂的空间结构，称为四 级结构。
图5.13 Elymus sibiricus ATPase α亚基 天冬氨酸位点
图5.14 Elymus sibiricus ATPaseα亚 基与β亚基结合位点
E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723
蛋白质的分子量及等电点
用DNA Tool 5.1软件分析了Elymus sibiricus ATPase α亚基的分子量和等电点，推测蛋白质的分
子量为55.5 kDa，等电点为6.22。
蛋白质的疏水区预测
ATPase α亚基N端和C端有较强的亲水性。
Predicted hydrophilicity plot of the deduced amino acid sequence of α subunit of ATPase
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
N端 β桶结构域
ATPaseα、β亚基 间C末端作用区域
ATPaseα亚基核心 结构域
3D structure prediction of ATPaseαsubunit in Elymus sibiricus
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
由5个 β 折 叠组成的 N 端区域
rgialnlesknvgivlmgdglmiqegsfvkatgrIAQIPVSEAYLGRVVNALAKPIDGRG rgialnlesknvgivlmgdglmiqegsfvkatgrIAQIPVSEAYLGRVINALAKPIDGRG vgialnleaknvgavlmgegtrvqegssvratgkIAQIPVGDGYLGRVVNSLARPIDGKG igialnleadnvgavlmgeatnlkegasvkttgkIAQIPVGRGFLGRVVDALARPIDGKG igialnlesdnvgvvlmgdgltiqegssvkatgkIAQIPVSDGYLGRVVNALAQPIDGKG lgialnleannvgavllgdglkitegsrvrctgkIAEIPVGEAYLGRVVDGLARPVDGKG igialnlesdnvgvvlmgegrgilegssvkatgkIAQVPVGKSYLGRVVNALGTPIDGKG EIiaSESRLIESPAPGIiSRRSVYEPMQTGLIAIDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAVA EIvaSESRLIESPAPGIiSRRSVYEPLQTGLIAIDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAVA EIatKENRLIESPAPGIiSRRSVHEPLQTGIVAIDAMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAIA DIasFTTRLIESPAPGIvSRRSVHEPLQTGLIAIDAMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAVA QIpaSEFRLIESSAPGIiSRRSVYEPMQTGLIAIDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKTAVA AVqtKDSRAIESPAPGIvARRSVYEPLATGLVAVDAMIPVGRGQRELIIGDRQTGKTAIA DIncSETRLIESIAPGIiSRKSVCEPIQTGITAIDSMIPIGRGQRELIIGDRQTGKSSVA TDTILNQKg~~~~~~~~qNVICVYVAIGQRASSVAQVVTNFQEEgameYTIVVAEMADSP TDTILNQKg~~~~~~~~qDVICVYVAIGQRASSVAQVVTTFHEEgameYTIVVAEMADSP VDTILNQKg~~~~~~~~kDVVCVYVAIGQKASSIAQVVNTLQERgamdYTIIVAATADSP TDTILNQKg~~~~~~~~qGVICVYVAIGQKASSVSQIVTTLEKRgameYTIIVAENADSS TDTILNQKg~~~~~~~~qNVICVYVAIGQKASSVAQVVNTFEERgaleYTIVVAEAANSP VDTILNQKg~~~~~~~~kGVICVYVAIGQKASSVAQVLNTLKERgaldYTIIVMANANEP IDTIINQKg~~~~~~~~eDVVCVYVAVGQKAATVASIVTTLEEKgaldYTCIVAANADDP ATLQYLAPYTGAALAEYFMYRERHTLIIYDDLSKQAQAYRQMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYLAPYTGAALAEYFMYRERHTLIIYDDLSKQAQAYRQMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYLSPYTGAALAEYFMYTGRHTLVIYDDLTKQAQAYREMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYLAPYTGAALAEYFMYNGKHTLVIYDDLSKQAQAYRQMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYLAPYTGAALAEYFMYRKQHTLIIYDDLSKQAQAYRQMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYLAPYTGATLAEYFMYTGRPTLTIYDDLSKQAQAYREMSLLLRRPPGREAYPGDVF ATLQYIAPYTGAAIAEYFMYNGQATLVIYDDLSKQASAYREMSLLLRRPPGREAFPGDVF YLHSRLLERAAKLNsllgeGSMTALPIVETQSGDVSAYIPTNVISITDGQIFLSADLFNA YLHSRLLERAAKLNsllgeGSMTALPIVETQSGDVSAYIPTNVISITDGQIFLSADLFNA YLHSRLLERAAKLNdklgsGSMTALPVVETQEGDVSAYIPTNVISITDGQIFLSADIFNA YLHSRLLERAAKLSdelgqGSMTALPIVETQAGDVSAYIPTNVISITDGQVFLSADIFNS YLHSRLLERAAKLSsqlgeGSMTALPIVETQAGDVSAYIPTNVISITDGQIFLSADLFNA YLHSRLLERAAKLNnalgeGSMTALPIVETQEGDVSAYIPTNVISITDGQIFLAAGLFNS YLHSRLLERAAKLSdklggGSMTALPVIETQAGDVSAYIPTNVISITDGQIFLSGDLFNA GIRPAInvGISVSRVGsaaqikamkqvagklklelaqfaelqafaqfasaldktsqnqla GIRPAInvGISVSRVGsaaqikamkqvagksklelaqfaelqafaqfasaldktsqnqla GIRPAInvGISVSRVGsaaqpkamkqvagklklelaqfaeleafsqfasdldqatqnqla GIRPAInvGISVSRVGsaaqikamkqvagklklelaqfaeleafsqfasdldqatqnqla GIRPAInvGISVSRVGsaaqikamkqvagklklelaqfaeleafaqfasdldkatqnqla GLRPAInvGISVSRVGsaaqpkamkqvagklklelaqfaeleafsqfasdldqatqnqla GIRPAInvGISVSRVGsaaqikamkqvagklklelaqfaeleafsqfasdldqatrnqla
PS00005 PKC_PHOSPHO_SITE Protein kinase C phosphorylation site :
PS00008 MYRISTYL N-myristoylation site : 62 200 243 312 353 361 67: - 205: - 248: - 317: - 358: - 366: GIalNL GQraSS GAalAE GSmtAL GIrpAI GIsvSR
第一节 概述
• 2.1.2 蛋白质工程的概念
蛋白质工程（Protein Engineering）是在对
蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行理化及生物分 析的基础上，采用基因工程技术对蛋白质进行修饰、 改造以提升其功能效率，甚至创造出新的功能蛋白质 的技术。 结构设计、 结构分析 预测 基因工程 功能分析 蛋白质纯 化
蛋白质的修饰位点分析
3 - 5: 92 - 94: 139 - 141: 174 - 176: 478 - 480: TlR TgR SrR TgK SsK
ATPaseα亚基 413～416位氨基酸为酰胺化位点（X-G-[RK][RK]）,序列中还存在5个蛋白激酶磷酸化位点（PKC）、4个 酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点（CK2）和6个N--豆蔻酰化位点 （MYRISTYL），说明其很容易受到多种因子的调控。
61 61 61 61 61 61 61 121 121 121 121 121 121 121 181 181 181 181 181 181 181 233 233 233 233 233 233 233 293 293 293 293 293 293 293 353 353 353 353 353 353 353
PS00009 AMIDATION Amidation site : 413 - 416: rGRR
蛋白质二级结构分析
Βιβλιοθήκη Baidu
Elymus sibiricus ATPaseα亚基含有比较丰富的二级结 构，其中较大的α螺旋有7个，较大β片层有11个。
Secondary structure prediction ofαsubunit of ATPase in Elymus sibiricus
核心结构域氨基酸保守性分析
核心结构域中，ATP结合位点是由下列15个氨基酸残基来构成的（图5.11中高亮显示 部分）：Arg172，Lys176，Thr177，Ala178，Tyr196，Gln201，Asp262，Asp263，Lys266，Glu321， Ser337，Pro350，Arg355，Pro356，Arg366。由氨基酸序列同源性比较可以看出，这些位点在 进化中均十分保守（图5.15中红色显示部分）。 核心结构域中，P环是负责与三磷酸盐结合区域，其构成通式是：（G/A） XXXXGK(T/S),川草2号老芒麦ATPaseα亚基中由下列8个氨基酸残基构成（图5.12中高亮显 示区）：Gly170，Asp171，Arg172，Gln173，Thr174，Gly175，Lys176，Thr177。由氨基酸序列同 源性比较可以看出，这些位点在进化中均十分保守(图5.15中显示绿色背景部分)。
Fig.5.9 The C-terminal domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
保守结构域
Ile95～Ala371
Fig.5.10 The central domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
呈漏斗状的由 8个平 行的β折叠和8个螺旋 构成的αβ桶
3D structure prediction of Rubisco large subunit in Elymus sibiricus
保守结构域
Ile26～Gly93
Gln372～Leu429
Fig.5.8 The N-terminal domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
PS00006 CK2_PHOSPHO_SITE Casein kinase II phosphorylation site : 142 337 401 481 145: 340: 404: 484: SvyE SitD SalD TftE
PS00017 ATP_GTP_A ATP/GTP-binding site motif A (P-loop) : 170 - 177: GdrqtGKT
列34个氨基酸残基构成：Ile116，Asp117，Pro133，Ala134，Gly136，Ile137，Arg140，Ser142，
Arg172，Gln173，Arg202，Ala203，Ser204，Ser205，Ala207，Gln208，Thr211，Arg272，Gln273， Arg279，Arg280，Pro281，Gly283，Arg284，Gly289，Tyr293，Ser296，Glu300，Ser337，Asp340， Asn351，Ala352，Arg355，Arg366。在图5.15中蓝色显示部分，在不同种间，有着极高的保 守性。
目的蛋白质
蛋白质氨基酸序列的分析 蛋白质晶体结构分析 蛋白质功能预测和分析 蛋白质组分析 改造蛋白质 的表达
目的基因 分子设计与结 构预测 改造目的基因
功能检测
目的产品
• 结构分析:
X-射线晶体衍射技术 核磁共振（NMR）
• 蛋白质结构预测与分子设计：
根据未知蛋白质氨基酸一级结构序列分析，利用 计算机信息技术，比较同源蛋白质的结构，按分子动 力学、分子力学原理和算法，建立蛋白质的立体模型 ，并依据结构与功能关系研究成果，对蛋白质分子进 行合理化改进设计。
图5.11 Elymus sibiricus ATPase α亚基 ATP结合位点
图5.12 Elymus sibiricus ATPase α亚基 三磷酸盐结合位点
核心结构域氨基酸保守性分析
核心区域内，天冬氨酸盐结合位点由下列5个氨基酸残基构成（图5.13中高亮显示部
分）：Ley258 ，Ile259 ，Ile260 ，Tyr261 ，Asp262 。该区域在不同种间均保持高度一致性 （图5.15中黄色背景显示部分）。 在核心区域内，α亚基与β亚基的结合区域见图（图5.14中高亮显示部分），由下
蛋白质及酶工程
本章主要内容：
第一节 概述 第二节 基因诱变技术 第三节 蛋白质的改造
第一节 概述
• 2.1.1 蛋白质基础
蛋白质的一级结构 ：是以肽键为主键或有
少量二硫键为副键的多肽链，显示氨基酸 种类和顺序的线性分子
蛋白质的二级结构：这是在一级结构的基
础上，借氢键在相邻两氨基酸残基之间的 引力使分子结构发生折曲的结构 α -螺旋（α - helix) β -折叠(β -pleated sheet)
蛋白质的三级结构：在二级结构的基础上由
氨基酸残基侧链相互作用而使多肽链 进一步盘旋折叠形成特定的三维构 象。参与维系结构的有氢键、离子 键、疏水键等。
蛋白质的四级结构：由两条或两条
以上多肽链组成的蛋白质，每个独立肽 链的三级结构称为亚单位，几个亚单位 之间通过氢键等化学键引力相互作 用形成更为复杂的空间结构，称为四 级结构。
图5.13 Elymus sibiricus ATPase α亚基 天冬氨酸位点
图5.14 Elymus sibiricus ATPaseα亚 基与β亚基结合位点
E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723
蛋白质的分子量及等电点
用DNA Tool 5.1软件分析了Elymus sibiricus ATPase α亚基的分子量和等电点，推测蛋白质的分
子量为55.5 kDa，等电点为6.22。
蛋白质的疏水区预测
ATPase α亚基N端和C端有较强的亲水性。
Predicted hydrophilicity plot of the deduced amino acid sequence of α subunit of ATPase
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
N端 β桶结构域
ATPaseα、β亚基 间C末端作用区域
ATPaseα亚基核心 结构域
3D structure prediction of ATPaseαsubunit in Elymus sibiricus
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
由5个 β 折 叠组成的 N 端区域
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PS00005 PKC_PHOSPHO_SITE Protein kinase C phosphorylation site :
PS00008 MYRISTYL N-myristoylation site : 62 200 243 312 353 361 67: - 205: - 248: - 317: - 358: - 366: GIalNL GQraSS GAalAE GSmtAL GIrpAI GIsvSR
第一节 概述
• 2.1.2 蛋白质工程的概念
蛋白质工程（Protein Engineering）是在对
蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行理化及生物分 析的基础上，采用基因工程技术对蛋白质进行修饰、 改造以提升其功能效率，甚至创造出新的功能蛋白质 的技术。 结构设计、 结构分析 预测 基因工程 功能分析 蛋白质纯 化
蛋白质的修饰位点分析
3 - 5: 92 - 94: 139 - 141: 174 - 176: 478 - 480: TlR TgR SrR TgK SsK
ATPaseα亚基 413～416位氨基酸为酰胺化位点（X-G-[RK][RK]）,序列中还存在5个蛋白激酶磷酸化位点（PKC）、4个 酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点（CK2）和6个N--豆蔻酰化位点 （MYRISTYL），说明其很容易受到多种因子的调控。
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PS00009 AMIDATION Amidation site : 413 - 416: rGRR
蛋白质二级结构分析
Βιβλιοθήκη Baidu
Elymus sibiricus ATPaseα亚基含有比较丰富的二级结 构，其中较大的α螺旋有7个，较大β片层有11个。
Secondary structure prediction ofαsubunit of ATPase in Elymus sibiricus
核心结构域氨基酸保守性分析
核心结构域中，ATP结合位点是由下列15个氨基酸残基来构成的（图5.11中高亮显示 部分）：Arg172，Lys176，Thr177，Ala178，Tyr196，Gln201，Asp262，Asp263，Lys266，Glu321， Ser337，Pro350，Arg355，Pro356，Arg366。由氨基酸序列同源性比较可以看出，这些位点在 进化中均十分保守（图5.15中红色显示部分）。 核心结构域中，P环是负责与三磷酸盐结合区域，其构成通式是：（G/A） XXXXGK(T/S),川草2号老芒麦ATPaseα亚基中由下列8个氨基酸残基构成（图5.12中高亮显 示区）：Gly170，Asp171，Arg172，Gln173，Thr174，Gly175，Lys176，Thr177。由氨基酸序列同 源性比较可以看出，这些位点在进化中均十分保守(图5.15中显示绿色背景部分)。
Fig.5.9 The C-terminal domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
保守结构域
Ile95～Ala371
Fig.5.10 The central domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
呈漏斗状的由 8个平 行的β折叠和8个螺旋 构成的αβ桶
3D structure prediction of Rubisco large subunit in Elymus sibiricus
保守结构域
Ile26～Gly93
Gln372～Leu429
Fig.5.8 The N-terminal domain of ATPase alpha subunit in Elymus sibiricus
PS00006 CK2_PHOSPHO_SITE Casein kinase II phosphorylation site : 142 337 401 481 145: 340: 404: 484: SvyE SitD SalD TftE
PS00017 ATP_GTP_A ATP/GTP-binding site motif A (P-loop) : 170 - 177: GdrqtGKT
列34个氨基酸残基构成：Ile116，Asp117，Pro133，Ala134，Gly136，Ile137，Arg140，Ser142，
Arg172，Gln173，Arg202，Ala203，Ser204，Ser205，Ala207，Gln208，Thr211，Arg272，Gln273， Arg279，Arg280，Pro281，Gly283，Arg284，Gly289，Tyr293，Ser296，Glu300，Ser337，Asp340， Asn351，Ala352，Arg355，Arg366。在图5.15中蓝色显示部分，在不同种间，有着极高的保 守性。
目的蛋白质
蛋白质氨基酸序列的分析 蛋白质晶体结构分析 蛋白质功能预测和分析 蛋白质组分析 改造蛋白质 的表达
目的基因 分子设计与结 构预测 改造目的基因
功能检测
目的产品
• 结构分析:
X-射线晶体衍射技术 核磁共振（NMR）
• 蛋白质结构预测与分子设计：
根据未知蛋白质氨基酸一级结构序列分析，利用 计算机信息技术，比较同源蛋白质的结构，按分子动 力学、分子力学原理和算法，建立蛋白质的立体模型 ，并依据结构与功能关系研究成果，对蛋白质分子进 行合理化改进设计。
图5.11 Elymus sibiricus ATPase α亚基 ATP结合位点
图5.12 Elymus sibiricus ATPase α亚基 三磷酸盐结合位点
核心结构域氨基酸保守性分析
核心区域内，天冬氨酸盐结合位点由下列5个氨基酸残基构成（图5.13中高亮显示部
分）：Ley258 ，Ile259 ，Ile260 ，Tyr261 ，Asp262 。该区域在不同种间均保持高度一致性 （图5.15中黄色背景显示部分）。 在核心区域内，α亚基与β亚基的结合区域见图（图5.14中高亮显示部分），由下