红曲霉转化中药葛根固体发酵条件研究_宋艳秋
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［ 2］
1. 1. 2. 1 （ PDA） 。 1. 1. 2. 2 1. 1. 2. 3
少及污染小等优点
， 已广泛应用于各类重要药物如抗生
素、 维生素、 甾体激素、 氨基酸、 芳基丙酸和前列腺素等的合 成， 同时由于微生物种类繁多、 繁殖快， 微生物转化常被用来 从而获得一些结构更合理或活 对天然产物的结构进行修饰， 性更好的先导化合物
［ 7］
Hale Waihona Puke Baidu
。开展中药
葛根的微生物转化研究， 对于提高葛根有效成分含量， 转化 产生新的活性成分， 减轻毒副作用等具有重要的意义。在工 培养基和培养条件对其转化效果影响 业化固体转化培养时， 很大， 因此笔者对筛选出的一株具有较好转化葛根有效成分 作用的红曲霉菌进行固体发酵条件的优化， 以期提高转化 并使转化率保持稳定。 率， 1 1. 1 材料与方法 材料
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.04.114
Journal of Anhui Agri. Sci. 2010 ， 38 （ 4 ） ： 1707 － 1708 ， 1745 安徽农业科学， 责任编辑 张杨林 责任校对 卢瑶
红曲霉转化中药葛根固体发酵条件研究
1 2 宋艳秋 ， 陈有为 （ 1. 大理学院公共卫生学院， 云南大理 671000 ； 2. 云南大学省微生物研究所， 云南昆明 650091 ）
摘要 ［ 目的］ 研究红曲霉转化中药葛根固体发酵的条件， 以期提高其转化率。［ 方法］ 对菌株 YM3207 转化葛根干粉的固体发酵培养条 通过菌种活化、 种子培养、 固体发酵培养方法以及正交试验考察了种子培养基、 底物投入量、 转化温度、 转 件和培养基进行了优化试验， 200 r / min 下培养 3 d 作为种子培养 化时间因素的影响与红曲霉转化条件。［ 结果］ 红曲霉菌 YM3207 菌株在 YPD 液体培养基中 28 ℃ 、 10% 接种量， 28 ℃ 培养 10 d 为红曲霉菌最佳转化条件； 培养基组成为葛根粉∶ 鲜 以中药葛根为底物， 条件最为合适； 采用固体发酵方式， 豆渣∶ 米粉为1∶ 1∶ 1， 含水量为 50% 时， 能够获得较高葛根素含量的转化产物。［ 结论］ 采用该条件发酵转化葛根能够提高葛根主要有效 利用微生物转化提高中药药效是可行的。 成分含量， 关键词 红曲霉； 葛根； 发酵条件 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2010） 04 － 01707 － 02 Study on the Solid Fermentation Conditions for Transforming Chinese Medicine Puerariae Radix with Monascus purpureus SONG Yanqiu et al （ College of Public Health， Dali University， Dali， Yunnan 671000 ） Abstract ［ Objective］The aim was to research the condition on solid fermentation conditions of Monascus purpureus for transforming Chinese medicine Puerariae radix in order to increase the conversion rate. ［ Method］The solid fermentation culture conditions and the medium of strain YM3207 for transforming the dry powder of Puerariae radix were made for the optimization test. Through the strain activation，seed culture， solid fermentation culture method and orthogonal test，the effects of some factors such as the seed medium，substrate input amount，transition Result ］The seed condition when temperature，transition time factors and the transition condition of Monascus purpureus were investigated. ［ the strain of Monascus purpureus YM3207 was cultured in the YPD liquid medium under 28 ℃ and 200 r / min for 3 d was optimum. The optimum transition condition of Monascus purpureus strain was as follows： taking Chinese medicine Puerariae radix as the substrate with inoculation amount of 10% and culturing for 10 d at 28 ℃ by using the solid fermentation method. When the medium compositions was Puerariae radix powder，fresh bean cake and rice flour with ratio of 1∶ 1∶ 1 and the water content as 50% ，the transition product with higher Puerariae radix content was obtained. ［ Conclusion］Using this fermentation condition for transforming Puerariae radix could increase the mainly effective composition content of Puerariae radix and it was feasible to transform and increase Chinese medicine by using microorganism. Key words Monascus purpureus； Puerariae radix； Fermentation condition
微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶使底物 进行有机反应
［ 1］
1. 1. 2
培养基。 固 体 斜 面 培 养 基。 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 液体种子培养基。液体 PDA 培养基、 察氏培养基、 固体转化培养基（ g /500 ml 玻璃瓶） 。 葛根干粉
。它具有选择性高、 反应条件温和、 副产品
［ 8］ 入 200 ml 浓度 70% 乙醇， 浸提 48 h ， 过滤得乙醇浸提液， 重
2. 2 2. 2. 1
固体发酵培养基的选择 米粉添加比例对转化产物中葛根素含量的影响。由
随着固体转化培养基中米粉添加比例的增加， 浸 图 2 可知， 这可能与红曲霉的生物学特 膏中葛根素的含量也逐渐增加， 性相关， 但是当米粉 ∶ 鲜豆渣 = 1∶ 1 之后， 继续增加米粉投入 葛根素含量增加不是很明显。考虑到生产成本， 固体 比例， 转化培养基中添加米粉与豆渣的比例以 1∶ 1较为适宜。
复 3 次， 合并浸提液， 经浓缩挥去乙醇得浸膏， 所得浸膏即为 待分析样品。 1. 2. 4 HPLC 法为 检测方法。以浸膏中葛根素含量为指标， 测定方法， 评价不同发酵条件的优劣。 4. 6 mm 色谱条件： 色谱柱选用 Symmetry C18 柱（ 5 μm， × 250. 0 mm） ； 流动相为甲醇 － 水梯度洗脱， 梯度洗脱条件见 检测波长 250 nm， 柱温为常温， 进样 表 1。流速 0. 4 ml / min， 量 10 μl。
1708
安徽农业科学
2010 年
析米粉添加比例对转化产物中葛根素含量的影响。 （ 2 ） 设 置 起 始 含 水 量 相 当 于 葛 根 干 粉 质 量 的 30% 、 40% 、 50% 、 60% 、 70% ， 以 10% 的接种量接种于混有 30 g 葛 15 g 鲜豆渣， 15 g 米粉的转化培养基中， 于（ 28 ± 根干粉， 2） ℃ 静置培养 15 d， 考察起始含水量对浸膏中葛根素含量的 影响。 1. 2. 2. 3 最佳固体转化条件的确定。 在以上试验的基础 选择种子培养基的接种量、 底物投入量、 转化时间、 转化 上， 各设 3 个水平进行正交试验， 以确定红 温度 4 个影响因素， 曲霉转化葛根固体发酵的最佳条件。 1. 2. 3 转化产物的提取。培养结束后， 在每个玻璃瓶中加
表1 Table 1 编号 No. 1 2 3 4 5 时间∥min Time 0 15. 00 20. 00 50. 00 55. 00 梯度洗脱条件 Fig. 2 水（ B） ∥% Water 58. 0 58. 0 15. 0 15. 0 58. 0 图2 content 米粉添加比例对葛根素含量的影响 Conditions of gradient elution 流量∥ml / min 甲醇（ A） ∥% Flow 0. 40 0. 40 0. 40 0. 40 0. 40 Methanol 42. 0 42. 0 85. 0 85. 0 42. 0 Effect of the adding proportion of rice flour on puerarin
1. 1. 1 菌种。红曲霉菌（ Monascus purpureus） （ 编号 YM3207） ， 由 云南大学省微生物研究所提供。
宋 艳 秋 （ 1983 － ） ， 女， 云 南 大 理 人， 助 教， 从事微生物学 研究。 1019 收稿日期 2009作者简介
的种子接入含有 30 g 葛根干粉和 30 g 不同比例混合的鲜豆 渣与米粉固体转化培养基中， 于（ 28 ± 2） ℃ 静置培养 15 d， 分
28 ℃ 静置培养 3 d， 斜面培养基， 活化待用。
菌种接入三角摇瓶中（ 50 ml 上述 4 种不同液体培养基 /250 ml 三角瓶） ， （ 28 ± 2 ） ℃ 、 200 r / min］ ， 摇瓶培养［ 每隔 24 h 取 4 种培养基各 1 瓶作为样本， 过滤菌液后测定菌丝体干重， 研 究不同种子培养基中菌体生物量随时间变化的趋势。 1. 2. 2. 2 固体发酵培养基的选择。 （ 1） 以 10% 的接种量将在液体 YPD 培养基中培养了 3 d
。中草药的微生物转化研究始于 20
世纪 80 年代， 经过多年的研究， 在真菌培养、 中药炮制、 次级 代谢物的修饰改造等方面已取得了可喜成绩。通过微生物 发酵中草药与一般的物理或化学加工方法相比能大幅度改 提高疗效， 降低毒副作用， 扩大适应症范围 变药性，
［ 4 － 6］
。葛
根为豆科植物野葛或粉葛的根， 其主要成分为大豆甙元、 大 葛根素等异黄酮类化合物， 对严重威胁人类生命健康 豆甙、 的心脑血管疾病具有重要的药理和治疗作用
［ 3］
酵母膏肽、 葡萄糖（ YPD） 培养基、 沙氏培养基。 （ 过 80 目筛） 30 g， 新鲜豆渣 + 水磨食米粉（ 过 80 目筛） 30 g， 在发酵过程中根据设计调整豆渣与米粉的混合比例以及添 加水的比例。 1. 1. 3 主要仪器和试剂。隔水式电热恒温培养箱（ 上海市 跃进医疗器械厂） ； 电子天平（ 中山市新和基科技开发有限公 司） ； TLC 平板（ 青岛海洋化工厂） ； 真空旋转蒸发仪（ EYELA 公司生产） ； 高效液相色谱仪（ 日本岛津） ； 甲醇（ 色谱纯） ； 乙 醇（ 食用级） 。 1. 2 1. 2. 1 1. 2. 2 1. 2. 2. 1 方法 菌种活化。将保存菌种红曲霉 YM3207 转接于 PDA 试验设计。 种子培养基及培养条件的选择。取活化好的斜面
1. 1. 2. 1 （ PDA） 。 1. 1. 2. 2 1. 1. 2. 3
少及污染小等优点
， 已广泛应用于各类重要药物如抗生
素、 维生素、 甾体激素、 氨基酸、 芳基丙酸和前列腺素等的合 成， 同时由于微生物种类繁多、 繁殖快， 微生物转化常被用来 从而获得一些结构更合理或活 对天然产物的结构进行修饰， 性更好的先导化合物
［ 7］
Hale Waihona Puke Baidu
。开展中药
葛根的微生物转化研究， 对于提高葛根有效成分含量， 转化 产生新的活性成分， 减轻毒副作用等具有重要的意义。在工 培养基和培养条件对其转化效果影响 业化固体转化培养时， 很大， 因此笔者对筛选出的一株具有较好转化葛根有效成分 作用的红曲霉菌进行固体发酵条件的优化， 以期提高转化 并使转化率保持稳定。 率， 1 1. 1 材料与方法 材料
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.04.114
Journal of Anhui Agri. Sci. 2010 ， 38 （ 4 ） ： 1707 － 1708 ， 1745 安徽农业科学， 责任编辑 张杨林 责任校对 卢瑶
红曲霉转化中药葛根固体发酵条件研究
1 2 宋艳秋 ， 陈有为 （ 1. 大理学院公共卫生学院， 云南大理 671000 ； 2. 云南大学省微生物研究所， 云南昆明 650091 ）
摘要 ［ 目的］ 研究红曲霉转化中药葛根固体发酵的条件， 以期提高其转化率。［ 方法］ 对菌株 YM3207 转化葛根干粉的固体发酵培养条 通过菌种活化、 种子培养、 固体发酵培养方法以及正交试验考察了种子培养基、 底物投入量、 转化温度、 转 件和培养基进行了优化试验， 200 r / min 下培养 3 d 作为种子培养 化时间因素的影响与红曲霉转化条件。［ 结果］ 红曲霉菌 YM3207 菌株在 YPD 液体培养基中 28 ℃ 、 10% 接种量， 28 ℃ 培养 10 d 为红曲霉菌最佳转化条件； 培养基组成为葛根粉∶ 鲜 以中药葛根为底物， 条件最为合适； 采用固体发酵方式， 豆渣∶ 米粉为1∶ 1∶ 1， 含水量为 50% 时， 能够获得较高葛根素含量的转化产物。［ 结论］ 采用该条件发酵转化葛根能够提高葛根主要有效 利用微生物转化提高中药药效是可行的。 成分含量， 关键词 红曲霉； 葛根； 发酵条件 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2010） 04 － 01707 － 02 Study on the Solid Fermentation Conditions for Transforming Chinese Medicine Puerariae Radix with Monascus purpureus SONG Yanqiu et al （ College of Public Health， Dali University， Dali， Yunnan 671000 ） Abstract ［ Objective］The aim was to research the condition on solid fermentation conditions of Monascus purpureus for transforming Chinese medicine Puerariae radix in order to increase the conversion rate. ［ Method］The solid fermentation culture conditions and the medium of strain YM3207 for transforming the dry powder of Puerariae radix were made for the optimization test. Through the strain activation，seed culture， solid fermentation culture method and orthogonal test，the effects of some factors such as the seed medium，substrate input amount，transition Result ］The seed condition when temperature，transition time factors and the transition condition of Monascus purpureus were investigated. ［ the strain of Monascus purpureus YM3207 was cultured in the YPD liquid medium under 28 ℃ and 200 r / min for 3 d was optimum. The optimum transition condition of Monascus purpureus strain was as follows： taking Chinese medicine Puerariae radix as the substrate with inoculation amount of 10% and culturing for 10 d at 28 ℃ by using the solid fermentation method. When the medium compositions was Puerariae radix powder，fresh bean cake and rice flour with ratio of 1∶ 1∶ 1 and the water content as 50% ，the transition product with higher Puerariae radix content was obtained. ［ Conclusion］Using this fermentation condition for transforming Puerariae radix could increase the mainly effective composition content of Puerariae radix and it was feasible to transform and increase Chinese medicine by using microorganism. Key words Monascus purpureus； Puerariae radix； Fermentation condition
微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶使底物 进行有机反应
［ 1］
1. 1. 2
培养基。 固 体 斜 面 培 养 基。 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 液体种子培养基。液体 PDA 培养基、 察氏培养基、 固体转化培养基（ g /500 ml 玻璃瓶） 。 葛根干粉
。它具有选择性高、 反应条件温和、 副产品
［ 8］ 入 200 ml 浓度 70% 乙醇， 浸提 48 h ， 过滤得乙醇浸提液， 重
2. 2 2. 2. 1
固体发酵培养基的选择 米粉添加比例对转化产物中葛根素含量的影响。由
随着固体转化培养基中米粉添加比例的增加， 浸 图 2 可知， 这可能与红曲霉的生物学特 膏中葛根素的含量也逐渐增加， 性相关， 但是当米粉 ∶ 鲜豆渣 = 1∶ 1 之后， 继续增加米粉投入 葛根素含量增加不是很明显。考虑到生产成本， 固体 比例， 转化培养基中添加米粉与豆渣的比例以 1∶ 1较为适宜。
复 3 次， 合并浸提液， 经浓缩挥去乙醇得浸膏， 所得浸膏即为 待分析样品。 1. 2. 4 HPLC 法为 检测方法。以浸膏中葛根素含量为指标， 测定方法， 评价不同发酵条件的优劣。 4. 6 mm 色谱条件： 色谱柱选用 Symmetry C18 柱（ 5 μm， × 250. 0 mm） ； 流动相为甲醇 － 水梯度洗脱， 梯度洗脱条件见 检测波长 250 nm， 柱温为常温， 进样 表 1。流速 0. 4 ml / min， 量 10 μl。
1708
安徽农业科学
2010 年
析米粉添加比例对转化产物中葛根素含量的影响。 （ 2 ） 设 置 起 始 含 水 量 相 当 于 葛 根 干 粉 质 量 的 30% 、 40% 、 50% 、 60% 、 70% ， 以 10% 的接种量接种于混有 30 g 葛 15 g 鲜豆渣， 15 g 米粉的转化培养基中， 于（ 28 ± 根干粉， 2） ℃ 静置培养 15 d， 考察起始含水量对浸膏中葛根素含量的 影响。 1. 2. 2. 3 最佳固体转化条件的确定。 在以上试验的基础 选择种子培养基的接种量、 底物投入量、 转化时间、 转化 上， 各设 3 个水平进行正交试验， 以确定红 温度 4 个影响因素， 曲霉转化葛根固体发酵的最佳条件。 1. 2. 3 转化产物的提取。培养结束后， 在每个玻璃瓶中加
表1 Table 1 编号 No. 1 2 3 4 5 时间∥min Time 0 15. 00 20. 00 50. 00 55. 00 梯度洗脱条件 Fig. 2 水（ B） ∥% Water 58. 0 58. 0 15. 0 15. 0 58. 0 图2 content 米粉添加比例对葛根素含量的影响 Conditions of gradient elution 流量∥ml / min 甲醇（ A） ∥% Flow 0. 40 0. 40 0. 40 0. 40 0. 40 Methanol 42. 0 42. 0 85. 0 85. 0 42. 0 Effect of the adding proportion of rice flour on puerarin
1. 1. 1 菌种。红曲霉菌（ Monascus purpureus） （ 编号 YM3207） ， 由 云南大学省微生物研究所提供。
宋 艳 秋 （ 1983 － ） ， 女， 云 南 大 理 人， 助 教， 从事微生物学 研究。 1019 收稿日期 2009作者简介
的种子接入含有 30 g 葛根干粉和 30 g 不同比例混合的鲜豆 渣与米粉固体转化培养基中， 于（ 28 ± 2） ℃ 静置培养 15 d， 分
28 ℃ 静置培养 3 d， 斜面培养基， 活化待用。
菌种接入三角摇瓶中（ 50 ml 上述 4 种不同液体培养基 /250 ml 三角瓶） ， （ 28 ± 2 ） ℃ 、 200 r / min］ ， 摇瓶培养［ 每隔 24 h 取 4 种培养基各 1 瓶作为样本， 过滤菌液后测定菌丝体干重， 研 究不同种子培养基中菌体生物量随时间变化的趋势。 1. 2. 2. 2 固体发酵培养基的选择。 （ 1） 以 10% 的接种量将在液体 YPD 培养基中培养了 3 d
。中草药的微生物转化研究始于 20
世纪 80 年代， 经过多年的研究， 在真菌培养、 中药炮制、 次级 代谢物的修饰改造等方面已取得了可喜成绩。通过微生物 发酵中草药与一般的物理或化学加工方法相比能大幅度改 提高疗效， 降低毒副作用， 扩大适应症范围 变药性，
［ 4 － 6］
。葛
根为豆科植物野葛或粉葛的根， 其主要成分为大豆甙元、 大 葛根素等异黄酮类化合物， 对严重威胁人类生命健康 豆甙、 的心脑血管疾病具有重要的药理和治疗作用
［ 3］
酵母膏肽、 葡萄糖（ YPD） 培养基、 沙氏培养基。 （ 过 80 目筛） 30 g， 新鲜豆渣 + 水磨食米粉（ 过 80 目筛） 30 g， 在发酵过程中根据设计调整豆渣与米粉的混合比例以及添 加水的比例。 1. 1. 3 主要仪器和试剂。隔水式电热恒温培养箱（ 上海市 跃进医疗器械厂） ； 电子天平（ 中山市新和基科技开发有限公 司） ； TLC 平板（ 青岛海洋化工厂） ； 真空旋转蒸发仪（ EYELA 公司生产） ； 高效液相色谱仪（ 日本岛津） ； 甲醇（ 色谱纯） ； 乙 醇（ 食用级） 。 1. 2 1. 2. 1 1. 2. 2 1. 2. 2. 1 方法 菌种活化。将保存菌种红曲霉 YM3207 转接于 PDA 试验设计。 种子培养基及培养条件的选择。取活化好的斜面