灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究

西岛表业学板2018年31卷2期318S o u t h w e s t C h i n a J o u r n a l of Agricultural S c i e n c e s Vol. 31N o. 2文章编号：l〇〇l -4829(2018)2 -0318 -04D O I：10. 16213/ki.scjas.2018. 2. 017灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究杨梦莉1’2，赖泳红1’3*，郭凤根4，崔晓龙1’3，王永霞1’3，肖炜1’3，李治滢1’3(1.云南大学生命科学学院/云南省微生物研究所，云南昆明650091;2.中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明650118;3.云南大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南昆明650091;4.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201)摘要：【目的】本研究对昆明市寻甸县人工栽培的大田灯盏花的根、茎、叶、花的内生真菌进行分离鉴定，旨在筛选产黄酮的内生 真菌菌株。

【方法】釆用纯培养方法分离植物内生真菌，利用形态鉴定及显色反应筛选产黄酮内生真菌。

【结果】共获得内生真菌 40株，经显微形态观察40株内生真菌初步分类鉴定为14个属。

通过黄酮类物质特异颜色反应，筛选到7株内生真菌产黄酮类物 质，这7株内生真菌经初步鉴定为交链孢属（Akemaria sp.)、镰孢霉属（Fusarium sp.)、痕格孢属（Sirosporium sp.)，根中内生菌产 黄酮最高质量浓度为2.625 mg/L。

【结论】灯盏花不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异性，从根部分离到的内生真菌产 黄酮类质量浓度最高。

关键词：灯盏花；内生真菌；多样性;黄酮中图分类号:Q93-331 文献标识码：AIsolation and Selection of Flavones-formingEndophytic Fungi from Erigeron breviscapusY A N G M e n g-l i1'2 ,L A I Y o n g-h o n g1'3 * ,G U O F e n g-g e n4 ,C U I X i a o-l o n g1'3 ,W A N G Y o n g-x i a1'3 ,X I A O W e i1'3 ,L I Z h i-y i n g1'3(1. Y u n n a n Institute of M i c r o b i o l o g y,S c h o o l of Life S c i e n c e s,Y u n n a n U niversity, Y u n n a n K u n m i n g650091,C h i n a；2.Institute of M e d i c a lB i o l o g yC h i n e s e A c a d e m y of M e d i c a l S c i e n c e s,Y u n n a n K u n m i n g650118 ,C h i n a；3.State K e y L a b o r a t o r y for C o n s e r v a t i o n a n d Utilization ofB i o-R e s o u r c e s in Y u n n a n,Y u n n a n U n i v e r s i t y,Y u n n a n K u n m i n g650091,C h i n a；4.C o l l e g e of A g r o n o m y a n d B i o t e c h n o l o g y,Y u n n a n A g r i­cultural U niversity, Y u n n a n K u n m i n g650201,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】 In o r d e r to s c r e e n e n d o p h y t i c fu ngi w h i c h c a n p r o d u c e f l a v o n o i d s,the e n d o p h y t i c f u n gi in r o ot s,s t e m s,leaves a n dflowers o f似 w e r e isolated a n d identified. [ M e t h o d] E n d o p h y t i c fun g i w e r e isolated b y u s i n g p u r e culture a n d selectsd u ce df l a v onoids s u b s t a n c e s b a s e d o n m o r p h o l og y a n d specific color reaction. [ R e s u l t]40e n d o ph y ti c f u n gi w e r e isolated f r o m6re-viscapus a n d identified to fo ur te en g e n e r a b a s e d o n m o r p h o l o g y a n d s c r e e n e d s e v e n strains p r o d u c e d flavon oi ds s u b s t a n c e s b y m e a n s of specif­ic color reaction. S e v e n strains p r o d u c e d fl avonoids s u b s t a n c e s w e r e identified as Alternaria sp. ,Fusarium sp. , a n d Sirosporium sp. T h e hig he s t quality co nc e n t r a t i o n of f lav onoids s u b s t a n c e s f r o m e n d o p h y t i c fu n g i roots w a s 2. 625m g/L.【C o n c l u s i o n】 It h a s s h o w n that q u a n t i t y, spe ci e s a n d distributing of the e n d o p h y t i e fungi varied in different parts of Erigeron breviscapus,a n d the c o n c e n tr at io n of flavono i ds s u b­sta nc e s f r o m e n d o p h y t i c f u n g i roots w a s the highest.K e y w o r d s：Erigeron breviscapus；E n d o p h y t i c fungi ；Diversity ；F l a v o n o i d s【研究意义】灯盖花又名灯盖细辛[£^妒「〇«/^- iiiscapiM (Vant. )Hand. -Mazz.],属菊科紫竞族飞蓬属多年生草本植物[1]，主要分布于云南、贵州、广 西、湖南、西藏等地。

作为一种药用植物，它具有散 寒解表、止痛舒络、除湿祛风等功效M。

黄酮是灯收稿日期=2017-01-16基金项目：国家自然科学基金（31660089);云南省科技条件平 台建设计划项目（2〇〇9D A O〇2);云南省教育厅基金（2〇15Y O〇2) 作者简介:杨梦莉（1987 -),女，硕士，云南永善人，主要从事微 生物资源研究，E-m a i l:y a n g m e n g l i7@163. c o m,*为通讯作者，瓦- m a i l:l a i y h l996@a l i y i m.c o m。

盏花重要的药效成分之一[3]，目前，临床上灯盏花 主要用于治疗中风、治疗脑梗塞、心绞痛及冠心病 等[4]。

灯盏花是一种需求量大的重要药用植物，值 得深入研究。

【前人研究进展】内生菌能促进植物 的生长、增加植株的抗逆性、产生多种代谢活性产 物、增加宿主植物的他感作用等[5]。

研究发现植物 内生菌的代谢产物与植物的药用物质表现出一致 性[6]，因此，若能筛选出产活性物质的内生真菌，就 能利用发酵技术生产有效的代谢物质。

【本研究切 入点】目前，关于灯盏花的研究大量集中在灯盏花2期杨梦莉等:灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究319的药理作用、HPLC测定及其生物学特性调查研究 等方面，而对于灯盏花内生真菌多样性及其产黄酮 真菌的筛选，只有国内李治滢[7]和何永美[8]等人曾 做过相关研究。

【拟解决的关键问题】本研究对灯 盏花内生真菌进行分离、鉴定，以揭示其内生真菌的 多样性，并对分离得到的内生真菌进行产黄酮内生 真菌筛选，为探索灯盏花药效成分新的生产途径提 供依据。

1材料与方法1.1供试植物灯盏花为一年生苗，由寻甸县灯盏花栽培基地 提供。

1.2分离培养基PDA培养基，查氏培养基[9]。

待倒平板时于培 养基中加青霉素（80 U/mL)抑制细菌生长。

1.3内生真菌的分离取灯盏花新鲜健康植株，分别对根、茎、花、叶用 自来水冲洗干净，用滤纸吸干水分，再用无菌水冲洗 3遍，放入75 %酒精浸泡1 ~2min,无菌水冲洗3 遍，再用0.1 %升汞消毒，无菌水清洗3次。

在无菌 条件下，用灭过菌的手术剪将植株各器官剪成长宽0. 5 c m X0.5 c m的小片，接种到真菌固体培养基 上，置于28 °C温箱培养4 ~ 10 d。

待各植物组织切 面长出菌落后挑取边缘部分，经纯化后即为灯盏花 内生真菌。

空白对照:将最后一次洗涤的灭菌水涂 布于空白平板中，28 °C培养，结果材料周围未见任 何菌长出，证明所得菌株为内生菌[M°]。

1.4分类鉴定对分离获得的灯盏花内生真菌进行插片法培 养，根据显微形态特征的观察并分类鉴定[9_11]。

1.5菌株液体发酵培养采用PDA液体培养基进行发酵，将在平板上活 化后的菌株接种于装有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶内。