实验6 水中大肠菌群

实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测

一、实验目的

1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。

2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。

二、实验原理

如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．

大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。

本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。

三、实验材料

1.培养基；

1.1乳糖胆汁液体培养基：

蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，

胆酸钠：5.0g

将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，

加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。

1.2伊红—美蓝琼脂(E.M.B)培养基

a.蛋白胨琼脂培养基(其成分为蛋白胨10.0g；琼脂18.0g；pH值为7.6)1000ml.

b.20％乳糖：2 ml ，

c.2%伊红溶液：2 ml，

d.0.5％美蓝溶液：1ml

将1000m1已灭菌的蛋白胨琼脂培养基加热溶化，冷却至60ºC左右时，将已灭菌的乳糖溶液、伊红溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入，摇匀后即倒平板上。乳糖在高温灭菌易被破坏，故必须严格控制灭菌温度，一般为115ºC，20min。

1.3亮绿乳糖胆汁(B.G..B)液体培养基

蛋白胨：10.0 g，亮绿：0.0133 g，乳糖：10.0 g，胆酸钠：20.0 g，蒸馏水：1000ml ，pH值7.4

分装试管后，加入杜汉氏小管，115ºC灭菌20min。

2灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染液、灭菌培养皿。

四、实验步骤

1.假定试验

1-1.用10 ml水样，接种到二倍浓度的乳精胆汁臂中去，重复接种三支。

1-2.用l ml水样，接种到一倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接种三支。

1-3.制备水样10-1和10-2的稀释液。

1-4.分别接种l ml10-1和10-2稀释液到一倍浓度的乳糖胆汁管中，每个稀释液接种三支。

1-5.在35ºC 中培养48h，观察有无气体和酸产生。

1-6.在48h以内，培养管内倒置的杜汉氏管中有任何量的气体积累，便可断定为阳性假定试验。若培养管内液体清晰而杜氏管中有气泡时，可能为放置不当而残存的空气泡，不可与产气的阳性反应相混同。无气泡者为阴性。产酸者呈黄色。

2.确信试验

2-1.取呈阳性和阳性可疑的初步发酵试管，轻轻振荡或转动，然后以无菌的金属接种环，转移l环培养物至亮绿乳糖胆汁管中1于35ºC培养48h。如在倒

置的杜汉氏管中产气，不论其量多寡，皆为阳性确信试验。

2-2.凡初步发酵试验管在24h之前就显示活跃的发酵(产气量占杜汉氏管10％以上)的试管，应及时转移至确信试验的培养基。

3.完成试验

3-1.取上述阳性确信试验管，在伊红—美蓝平板上划线分离，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：a．划线间距至少相隔0.5cm；b．接种针尖端要稍弯曲；c．先对发酵管轻击，并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣，d．划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面，以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于35ºC 培养24h。

3-2.24h后，观察在EMB平板上出现的单个菌落，具核心及深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置于37ºC培养24h．挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在。

图1.大肠菌群细菌的检测

3-3.在EMB平板上呈较典型的大肠菌群细菌还可再次转接至乳糖胆汁发酵管中，在37ºC下培养48h，产生气体者即确认了大肠菌群细菌的存在。

3-4.根据证实有大肠菌群细菌存在的阳性管数查表1-2，以确定大肠菌群数。整个试验的步骤见图1所示。

阳性：乳酸胆汁管，产气；营养琼脂斜面，革兰氏阴性杆菌。 阴性：具其他特征的微生物。 五、结果及分析

表2 最近似数(MPN)指数和95%置信度检索

将上述各个试验阶段的结果列表记录，并最后算出水中所含大肠菌群的最大可能值(表2）

本试验所用的培养基系选择培养基，许多细菌都不能利用培养基中的乳糖来发酵产气产酸，而大肠菌群细菌及少数其他种类的细菌可发酵乳糖产气产酸。培养基中的胆汁(牛、羊或猪的胆酸盐)是表面活性剂，它不会抑制大肠菌群细菌的生长，但能抑制其他革兰氏阳性细菌，如芽孢形成菌的生长。在胆汁缺乏时可用