微生物鉴定中的生理生化试验

微生物鉴定中的生理生化试验
一．实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不
同的酶系统。

2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。

3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。

4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。

二．实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

具体的原理如下：
1.大分子水解试验
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。

胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。

如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。

如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。

脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。

2. 糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。

例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。

当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。

气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

3．IMViC试验
IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methyl red test）、伏-普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。

硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。

大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。

吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲
哚和丙酮酸。

对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。

但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

色氨酸水解反应：
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。

当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.3）转变为红色（pH4.2），即甲基红反应。

尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。

这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

三．实验器材
1. 菌种
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌。

2. 培养基和试剂
（1）培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基。

（2）溶液和试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、中性红试剂等。

3. 仪器及其它用品
酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、试管、烧杯、量筒、德汉氏小管、无菌操作台等。

四．操作步骤
1. 培养基的配制及灭菌
按附录所示配方称量各组分，配制培养基（注意：在配置油脂培养基时不能使用变质油，油和琼脂及水先加热，调好PH后最后加入中性红；在配置糖发酵培养基时将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（PH7.6）以及糖溶液分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使之充满培养基）。

配制分装包扎完成后放入灭菌锅中113℃灭菌20min。

2. 倒平板，接种及培养 （1）淀粉水解试验
① 倒平板：无菌条件下将冷却至50℃下的淀粉培养基倒平板并冷却至室温。

② 接种及培养：用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。

将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域点种（注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图1）。

接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。

（2）油脂水解试验
① 倒平板：无菌条件下将冷却至50℃下的油脂培养基倒平板并冷却至室温（注：倒平板时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中）；
② 接种及培养：用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。

将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域划十字线接种（如上图2所示）。

接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。

（3）糖酵解试验
① 葡萄糖酵解的接种及培养：用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，普通变形杆菌）。

取盛有葡萄糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌， 2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。

接种完成后在37℃条件下培养两天。

② 乳糖酵解的接种及培养：用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，普通变形杆菌）。

取盛有乳糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌，2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。

接种完成后在37℃条件下培养两天。

（4）IMViC 试验
① 吲哚实验的接种及培养：用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。

取盛有蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。

接种完成后在37℃条件下培养两天。

② 甲基红实验的接种及培养：用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。

取盛有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。

接种完成后在37℃条件下培养两天。

图 1淀粉水解试验接种示意图
图 2油脂水解试验接种示意图
3.结果的检验
（1）大分子水解试验的检验
①淀粉水解试验的检验：观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察水解圈，出现水解圈的为阳性，记录试验结果。

②油脂水解试验的检验：取出平板，观察各种细菌产生的菌苔颜色，出现红色菌苔的为阳性，记录试验结果。

（2）糖发酵试验的检验：取出各试管，与空白对照组对照观察培养基的颜色以及倒立的小管中气泡的有无，若培养基变成黄色则说明细菌分解糖类并产酸；若倒立的小管中有气泡存在，则说明细菌分解糖类并产气。

产酸产气的为阳性。

（3）IMViC试验的检验
①吲哚试验的检验：取出各试管，向培养基中加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。

②甲基红试验的检验：取出各试管，向培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。

培养基变黄为阴性，红为阳性。

五．实验结果及分析
1.实验结果（理论实验结果）
A．大分子物质的水解试验
（1）淀粉水解试验（我们的实验也得到了预期的结果）
表1 淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
（2）油脂水解试验
表2 油脂水解试验(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
B.糖发酵试验
（1）葡萄糖发酵试验
表3 葡萄糖发酵试验（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
（2）乳糖发酵试验
表4 乳糖发酵试验（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
C.IMViC试验
（1）吲哚试验
表5 吲哚试验（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
（2）甲基红试验
表6 甲基红试验（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
2.实验结果分析
理想上的试验结果如上述表格所示，但是我们组的实验只有淀粉水解试验是成功的，其他的是失败的。

其中由淀粉水解试验可以得出枯草芽孢杆菌和大肠杆菌能产生淀粉酶的结论，枯草芽孢
杆菌菌落周围的透明圈较大肠杆菌周围的透明圈大，可以大体判断前者较后者代谢利用淀粉的能力强。

通过油脂水解试验，理想上的结果是铜绿假单胞菌能产生脂肪酶分解脂肪从而出现红色斑点状菌苔，但可能是培养基的原因，我们的实验失败了。

通过糖酵解实验，理想结果应为大肠杆菌和普通变形菌都能够分解葡萄糖，但是普通变形菌不能够分解乳糖。

但实验结果却是普通变形菌不能分解乳糖，与事实相违背，实验失败。

究其原因可能是菌种在接种时出现失误而接种失败或是菌种本身存在有问题，还有可能是接种量太少，培养时间不够等原因。

在吲哚试验中，理想结果是大肠杆菌具有分解色氨酸产生吲哚的能力，而产气肠杆菌不能分解色氨酸为吲哚。

在甲基红实验中，理论上是大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH，产气肠杆菌转化有机酸为非酸性末端产物，我们的实验也失败了，试验失败有可能是因为培养基配错或菌种的原因。

六．注意事项
1.淀粉水解试验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，应轻轻
旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

2.油脂水解试验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。

3.接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。

4.糖发酵试验中，接种后要轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。

否则
会造成假象，得出错误的结果。

5.吲哚试验中，注意加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试
管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。

否则就会观察不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。

6.甲基红试验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。

七．思考题
1.你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。

2.不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。

呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。

3.假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
答：由于产生的CO
溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。

德汉氏小
2
管中有气柱。

4.讨论IMViC试验在医学检验上的意义。

答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。

5.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸
酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。

对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。

附录实验中用到的各种培养基配方
1．固体淀粉培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
牛肉膏 5g
可溶性淀粉 2g
蒸馏水 1000mL
琼脂 15~20g
121℃灭菌20min。

2．固体油脂培养基
蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
NaCl 5g
香油或花生油 10g
1.6%中性红水溶液 1mL
琼脂 15~20g
蒸馏水 1000mL
pH 7.2
121℃灭菌20min。

注：（1）不能使用变质油。

（2）油和琼脂及水先加热。

（3）调好pH后再加入中性红。

（4）分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。

3. 葡萄糖发酵培养
蛋白胨水培养基 1000mL
NaCl 5g
葡萄糖 12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2mL
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
110℃灭菌30min。

4. 乳糖发酵培养基
蛋白胨水培养基 1000mL NaCl 5g
乳糖 12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2mL
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
110℃灭菌30min。

5．蛋白胨水培养基
蛋白胨 10g
NaCl 5g
蒸馏水 1000mL
pH 7.6
121℃灭菌20min。

6.葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨 5g
葡萄糖 5g
K 2HPO
4
2g
蒸馏水 1000mL
将上述各成分溶于1000mL水中，调pH 7.0~7.2，过滤。

分装试管，每管10mL，112℃灭菌30min。