男性学实验室检查与质控
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如囊胚形成率≥75%，或与对照组囊胚形成率间 无统计学差异，则培养液合格。
④
精浆锌：与精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有关 精浆柠檬酸：与前列腺分泌功能，精液液化有关 精浆酸性磷酸酶:与前列腺炎有关 判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标，顶体酶 活性降低精子将难以穿透卵细胞从而导致不育。
精子顶体酶活性定量检测
核蛋白组型转换
蛋白组型转换缺陷或异常可引起男性不育或胚胎早期夭折 流产。
①
方法
在锥形离心管底依次加入1.5－2ml 80％、40％ Puresperm液。 将2ml精液加到40％ Puresperm液界面上，离心 300g×20” 弃上层液体、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、离心 500g×10’同法洗涤2次 留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子悬液备用。
每季――校正加样器；
每年――校正计数板和其他设备。
质控图的基本控制原则 控制原则
一个结果超出处置限
连续两个结果都超出警戒上限 或低于警戒下限 连续两个结果,一个高于警戒上限, 一个低于警戒下限 连续八个结果全部高于或低于均值 系统性误差 随机误差
误差敏感
随机误差或系统误差
系统误差
培养液、一次性耗材质量检测
①
精子体外存活试验
液化精液1：3加入培养液500×10’ 离心去上清 液，重复洗涤一次。
②
留沉淀物制成1ml精子悬液，再加入2ml培养液 使其形成上下二层界面，37℃、5％CO2孵箱中 静置1小时。 吸取上清夜，调节上游精子密度105—106/ml， 活率>95％。
37℃、5％CO2孵箱内培养3天，活率>70%。
2.0ml或更多 7.2或更多
精子密度
总精子数 活力 畸形率 存活率 白细胞
20×106／ml或更多
40×106/一次射精或更多 射精后60分钟内，50％或更多具有前向运动
（即a+b级），或25％或更多具有快速前向运动（a级）
＜
85％
50％或更多存活 ＜1×106／ml
该指标参考《WHO人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册（第四版）
男性学组合项目
免疫性不育检测指标:精子膜表面抗体 混合凝集反应（MAR） 检测的是不需要任何处理的精子
和免疫珠试验（IBT）检测的是经洗涤后的精子
阳性
>10%活动精子包裹在致敏微球上
MAR是WHO推荐的免疫性不育诊断方法 作为精子膜表面抗体常规筛选方法
男性学组合项目二
前列腺分泌功能指标
②
③ ④
精液分析在男性生殖力的评估中
起着极为重要的作用,但是不同实验室 测同一份样本的结果常有较大差异
这说明男性学实验室各项指标
的质控是结果可信度的保证
男性学实验室质量控制规则
随时――样本结果的监测和对比； 每周――分析不同技术员所做的主要精液
指标的重复测量值；
每月――分析检测结果的月均值；
山西省儿童医院 妇幼保健院 生殖中心 男性学实验室
王振强
zhen-qiang wang
不育症的发生率为10％－15％，其中约30％
由于男性因素引起的，统称为男性不育症。
男性不育症患者大部分没有明显的临床症状。 实验室检测是评价男性生殖能力的重要手段。
精液分析正常参考值：
量 PH
结果报告
正常 精子穿透粘液90%以上具有直线运动的精子 精子穿透粘液相的距离<500um（约10个精子的长度） 异常 精子穿透粘液相，但很快失活或仅作“抖动”表示抗精子抗体的存在 精子未穿透精液—粘液的接触界面。
男性学组合项目
精液分析操作常规 (参照《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》第四版) 精液标本采集时间应在禁欲后2-7天。嘱病人按《取精指南》在实验室设立的取精室 内采集精液。记录病人及其妻子姓名、联系电话、禁欲时间、标本采集时间及标本 分析时间、采集是否完全。 记录精液总量、PH、液化时间、液化状态、外观、粘稠度。 显微镜初检： 用高倍镜（40×）观察10个视野，初步估计精子密度、活力、精子凝集和非精子细 胞。 估记精子密度>40×106/ml时，用F-10培养液按比例稀释精液，以避免精子碰撞造 成分析错误。取一滴精液置Hamilton CASA系统进行分析。 系统设置：CASA系统温度设置为37℃，根据精子密度选择Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子分析）。 应选择精子分布均匀的视野扫描，如精子密度>20×106/ml时，应分析超过400条精 子。 显微镜检查未见精子的标本应用3000g离心15分钟，把所有沉渣重新悬浮成0.2ml， 再彻底检查后发现无精子，才能作出无精子的判断。 如离心后发现有精子可按下列公式计算精子密度。 离心后体积×精子密度 精液总量 精子密度（×106/ml） 8． 精子存活率计数 将新鲜精液与伊红染液1：1在试管中混匀，30秒后取一滴上述液体置载玻片上并覆 以盖玻片在400倍光学显微镜下观察。活精子不着色，死精子被染成红色，观察200 个精子计数存活率。
④ ⑤
5％CO2、37℃孵箱内静置1h。
收集上游精子，备用
密度梯度离心法
目的：利用不同成熟阶段的精子和各种细胞成分各自的
密度，差异使之在不同浓度的溶液中，在离心力作用下 停留在不同密度面的界面上，达到较好的分离。适用于 精液粘稠、严重少精 弱精症。 *标准二层Puresperm法(80%、40%)
男性学组合项目
精子顶体酶测定
顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上， 是受精过程中重要的蛋白水解酶. 当精子头部进入卵透明带，顶体酶原被活化为顶 体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与 卵子融合。 顶体酶活性反映精子质量，顶体酶活力不足可能 导致不育。临床精子成活率低、死精子症以及严 重生殖系统感染，特别是溶脲支原体严重感染时 可造成精子顶体酶活性降低。 顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的 重要评价指标。
③
④
①
小鼠2-细胞胚胎发育实验
常规促排卵方法处理雌性KM小鼠，注射HCG后 雌雄1:1合笼，第二天阴栓阳性的雌鼠留用。 实验前一天，分组准备培养液，并设对照组。标 记后置37℃, 5%CO2培养箱平衡过夜。
②
③
注射hCG 42h左右，颈椎脱臼法处死已见栓雌鼠， 无菌条件下获取2-细胞胚胎，随机分组，每组至 少有胚胎20个。37℃, 5%CO2培养箱中培养，培 养72h记录已充分扩展的囊胚数。
精子体外处理方法：
洗涤法 上游法 密度梯度离心法
①
Baidu Nhomakorabea洗涤法
目的：增加活动精子密度和洗去精浆中影响精子活力
的物质，如白细胞、细菌、抗精子抗体等。
方法：
选用Ham’s F10、HTF、Earle’s等上述任何一种培养 液，加10％血清及抗生素。 液化精液移于15ml锥形离心管内，加3倍剂量的培养液。 离心500g×8’，弃上清夜，同法重复洗涤一次。 留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液，密度调整为 >40×106/ml
男性学组合项目
1.
计算机辅助精子分析（CASA）
VCL-曲线速度（μ m/s）精子头沿其实际的曲线。 VSL-直线速度（μ m/s）根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之 间的直线运动的时间平均速度。 VAP-平均路径速度（μ m/s）精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。 ALH－精子头侧摆幅度（μ m/s）精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。 LIH-直线性。曲线轨迹的直线性。VSL/VCL. WOB-摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL. STR-前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP. BCF-鞭打频率（鞭打次数、秒）。精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时 间平均速度。 MAD-平均移动角度（度）精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝 对值。
多重精子缺陷指数分析 临床意义： 形态异常的精子经常有多种缺陷。在较早的方案 中，当多种缺陷同时存在时，只记录其中一种， 即头部的缺陷先于中段的缺陷，中段的缺陷先于 尾部的缺陷。现在用一种叫做畸形精子指数的方 法（teratozoospermia index,TZI）或多种异常指 数（multiple anomalies index,MAI），即用缺陷 总数除以畸形精子数目，以及用精子畸形指数 （sperm deformity index,SDI），即缺陷总数除 以精子总数。这些参数预示精子在体内和体外的 功能情况。畸形精子指数的数值介于1.00（每个 异常精子只有一种缺陷）和3.00（每个异常精子 都有头、中段及尾部缺陷）之间。报道提示，畸 形精子指数（TZI）>1.6与未治疗不育夫妇的低生 育率有关，精子畸形指数SDI >1.6提示体外受精 失败的阈值。
男性学组合项目
9． 精子形态评估：
涂片
取一小滴精液（5 ~ 20 ul）于载玻片上，以另一推片把精液推成薄片， 干燥。如果精子密度超过20×106 / ml, 取5μl，精子密度 <20μl ,应取 10～20μl精液。
染色方法 精子形态分类
采用改良巴氏染色。实验方法见附2。
在100×油镜下及10×目镜分析200条带尾部的可辨认精子的形态。 计数百分率。报告四种类型缺陷：头部畸型、颈部和中段畸型、尾部 畸型、混合畸型。按照第四版精子形态分类标准，将所有形态学处于 临界状态的精子均列为异常。 在形态分类的同时如果见到许多尖头，需要单独记录。
② ③ ④
上游法
目的：
利用活动精子具有主动游过液体界面进入不同培养液 的能力，而达到自行与死精，凝集精子，畸形精子和 细胞杂质分离。 适用于正常精液\液化不良精液。
方法：
① ② ③
液化精液1：3加入培养液，离心200g×8’，洗涤2次。
留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液。
取另一支试管加入1ml培养液，将0.5ml精子悬液慢慢 加入试管底部，形成上下二个两面。
精子活力分级:a，快速直线前向运动；b，慢或缓慢的前向运动； C，非前向运动；d，不活动精子。
意义: 能够提供精子寿命和存活情况. 前向运动的精子可排除宫颈因素作为不育原因的可能性。
简化的玻片试验
将一滴宫颈粘液置于载玻片上，用盖玻片铺平。 载玻片两侧各滴1滴精液，使其与盖玻片边缘接触，借助于毛 细作用使精液移向盖玻片下，在宫颈粘液与精液之间形成一 个清晰的接触界面。 该载玻片置于湿润的温箱内，37孵育30分钟
精子形态分析时，同时计数非精子细胞成份，包括未成熟精细胞和白细 胞等。按下列公式计数精液中的非精子细胞密度。
C= N×S 100 N= 计数100个精子相同视野中一种特定细胞类型的数目。 S= 精子细胞密度（106 / ml）。 C= 特定细胞类型密度（106 / ml）。
精子—宫颈粘液相互作用检测
体内试验（性交后试验）PCT
1. 时间选择 在排卵期进行。 2. >2天避免性生活,性交后9—12小时进行试验. 3. 在阴道后穹窿部吸取混合样本及用另一个注射器或导管 吸取宫颈管内的粘液标本。 4. 将这些标本置于载玻片上，加盖玻片，显微镜观察 结果观察 性交后9—12小时进行
精液变量的术语：
正常精子状态
射出的精液符合参考值
少精子症 精子浓度低于参考值 (精子密度<20×106／ml或总精子数<40×106/一次射精) 弱精子症 精子活力低于参考值(a+b级<50％或a级<25 ％) 畸精子症 具有正常形态的精子少于参考值(正常形态 <15%) 少、弱、畸精子症 表示3种变量均异常（两种变量异常时，可 用两个前缀） 无精子症 所射精液中无精子 无精液症 不射精
④
精浆锌：与精子活力、抗氧化及前列腺分泌功能有关 精浆柠檬酸：与前列腺分泌功能，精液液化有关 精浆酸性磷酸酶:与前列腺炎有关 判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标，顶体酶 活性降低精子将难以穿透卵细胞从而导致不育。
精子顶体酶活性定量检测
核蛋白组型转换
蛋白组型转换缺陷或异常可引起男性不育或胚胎早期夭折 流产。
①
方法
在锥形离心管底依次加入1.5－2ml 80％、40％ Puresperm液。 将2ml精液加到40％ Puresperm液界面上，离心 300g×20” 弃上层液体、留沉淀物、加5ml Puresperm wash、离心 500g×10’同法洗涤2次 留沉淀物，加0.5ml SpermAssist制成精子悬液备用。
每季――校正加样器；
每年――校正计数板和其他设备。
质控图的基本控制原则 控制原则
一个结果超出处置限
连续两个结果都超出警戒上限 或低于警戒下限 连续两个结果,一个高于警戒上限, 一个低于警戒下限 连续八个结果全部高于或低于均值 系统性误差 随机误差
误差敏感
随机误差或系统误差
系统误差
培养液、一次性耗材质量检测
①
精子体外存活试验
液化精液1：3加入培养液500×10’ 离心去上清 液，重复洗涤一次。
②
留沉淀物制成1ml精子悬液，再加入2ml培养液 使其形成上下二层界面，37℃、5％CO2孵箱中 静置1小时。 吸取上清夜，调节上游精子密度105—106/ml， 活率>95％。
37℃、5％CO2孵箱内培养3天，活率>70%。
2.0ml或更多 7.2或更多
精子密度
总精子数 活力 畸形率 存活率 白细胞
20×106／ml或更多
40×106/一次射精或更多 射精后60分钟内，50％或更多具有前向运动
（即a+b级），或25％或更多具有快速前向运动（a级）
＜
85％
50％或更多存活 ＜1×106／ml
该指标参考《WHO人类精液及精子宫颈粘液相互作用实验室检验手册（第四版）
男性学组合项目
免疫性不育检测指标:精子膜表面抗体 混合凝集反应（MAR） 检测的是不需要任何处理的精子
和免疫珠试验（IBT）检测的是经洗涤后的精子
阳性
>10%活动精子包裹在致敏微球上
MAR是WHO推荐的免疫性不育诊断方法 作为精子膜表面抗体常规筛选方法
男性学组合项目二
前列腺分泌功能指标
②
③ ④
精液分析在男性生殖力的评估中
起着极为重要的作用,但是不同实验室 测同一份样本的结果常有较大差异
这说明男性学实验室各项指标
的质控是结果可信度的保证
男性学实验室质量控制规则
随时――样本结果的监测和对比； 每周――分析不同技术员所做的主要精液
指标的重复测量值；
每月――分析检测结果的月均值；
山西省儿童医院 妇幼保健院 生殖中心 男性学实验室
王振强
zhen-qiang wang
不育症的发生率为10％－15％，其中约30％
由于男性因素引起的，统称为男性不育症。
男性不育症患者大部分没有明显的临床症状。 实验室检测是评价男性生殖能力的重要手段。
精液分析正常参考值：
量 PH
结果报告
正常 精子穿透粘液90%以上具有直线运动的精子 精子穿透粘液相的距离<500um（约10个精子的长度） 异常 精子穿透粘液相，但很快失活或仅作“抖动”表示抗精子抗体的存在 精子未穿透精液—粘液的接触界面。
男性学组合项目
精液分析操作常规 (参照《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》第四版) 精液标本采集时间应在禁欲后2-7天。嘱病人按《取精指南》在实验室设立的取精室 内采集精液。记录病人及其妻子姓名、联系电话、禁欲时间、标本采集时间及标本 分析时间、采集是否完全。 记录精液总量、PH、液化时间、液化状态、外观、粘稠度。 显微镜初检： 用高倍镜（40×）观察10个视野，初步估计精子密度、活力、精子凝集和非精子细 胞。 估记精子密度>40×106/ml时，用F-10培养液按比例稀释精液，以避免精子碰撞造 成分析错误。取一滴精液置Hamilton CASA系统进行分析。 系统设置：CASA系统温度设置为37℃，根据精子密度选择Analysis setup: Standard、High density、user-1（低密度精子分析）。 应选择精子分布均匀的视野扫描，如精子密度>20×106/ml时，应分析超过400条精 子。 显微镜检查未见精子的标本应用3000g离心15分钟，把所有沉渣重新悬浮成0.2ml， 再彻底检查后发现无精子，才能作出无精子的判断。 如离心后发现有精子可按下列公式计算精子密度。 离心后体积×精子密度 精液总量 精子密度（×106/ml） 8． 精子存活率计数 将新鲜精液与伊红染液1：1在试管中混匀，30秒后取一滴上述液体置载玻片上并覆 以盖玻片在400倍光学显微镜下观察。活精子不着色，死精子被染成红色，观察200 个精子计数存活率。
④ ⑤
5％CO2、37℃孵箱内静置1h。
收集上游精子，备用
密度梯度离心法
目的：利用不同成熟阶段的精子和各种细胞成分各自的
密度，差异使之在不同浓度的溶液中，在离心力作用下 停留在不同密度面的界面上，达到较好的分离。适用于 精液粘稠、严重少精 弱精症。 *标准二层Puresperm法(80%、40%)
男性学组合项目
精子顶体酶测定
顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上， 是受精过程中重要的蛋白水解酶. 当精子头部进入卵透明带，顶体酶原被活化为顶 体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与 卵子融合。 顶体酶活性反映精子质量，顶体酶活力不足可能 导致不育。临床精子成活率低、死精子症以及严 重生殖系统感染，特别是溶脲支原体严重感染时 可造成精子顶体酶活性降低。 顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的 重要评价指标。
③
④
①
小鼠2-细胞胚胎发育实验
常规促排卵方法处理雌性KM小鼠，注射HCG后 雌雄1:1合笼，第二天阴栓阳性的雌鼠留用。 实验前一天，分组准备培养液，并设对照组。标 记后置37℃, 5%CO2培养箱平衡过夜。
②
③
注射hCG 42h左右，颈椎脱臼法处死已见栓雌鼠， 无菌条件下获取2-细胞胚胎，随机分组，每组至 少有胚胎20个。37℃, 5%CO2培养箱中培养，培 养72h记录已充分扩展的囊胚数。
精子体外处理方法：
洗涤法 上游法 密度梯度离心法
①
Baidu Nhomakorabea洗涤法
目的：增加活动精子密度和洗去精浆中影响精子活力
的物质，如白细胞、细菌、抗精子抗体等。
方法：
选用Ham’s F10、HTF、Earle’s等上述任何一种培养 液，加10％血清及抗生素。 液化精液移于15ml锥形离心管内，加3倍剂量的培养液。 离心500g×8’，弃上清夜，同法重复洗涤一次。 留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液，密度调整为 >40×106/ml
男性学组合项目
1.
计算机辅助精子分析（CASA）
VCL-曲线速度（μ m/s）精子头沿其实际的曲线。 VSL-直线速度（μ m/s）根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之 间的直线运动的时间平均速度。 VAP-平均路径速度（μ m/s）精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。 ALH－精子头侧摆幅度（μ m/s）精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度。 LIH-直线性。曲线轨迹的直线性。VSL/VCL. WOB-摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL. STR-前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP. BCF-鞭打频率（鞭打次数、秒）。精子曲线轨迹越过其平均路径轨迹的时 间平均速度。 MAD-平均移动角度（度）精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝 对值。
多重精子缺陷指数分析 临床意义： 形态异常的精子经常有多种缺陷。在较早的方案 中，当多种缺陷同时存在时，只记录其中一种， 即头部的缺陷先于中段的缺陷，中段的缺陷先于 尾部的缺陷。现在用一种叫做畸形精子指数的方 法（teratozoospermia index,TZI）或多种异常指 数（multiple anomalies index,MAI），即用缺陷 总数除以畸形精子数目，以及用精子畸形指数 （sperm deformity index,SDI），即缺陷总数除 以精子总数。这些参数预示精子在体内和体外的 功能情况。畸形精子指数的数值介于1.00（每个 异常精子只有一种缺陷）和3.00（每个异常精子 都有头、中段及尾部缺陷）之间。报道提示，畸 形精子指数（TZI）>1.6与未治疗不育夫妇的低生 育率有关，精子畸形指数SDI >1.6提示体外受精 失败的阈值。
男性学组合项目
9． 精子形态评估：
涂片
取一小滴精液（5 ~ 20 ul）于载玻片上，以另一推片把精液推成薄片， 干燥。如果精子密度超过20×106 / ml, 取5μl，精子密度 <20μl ,应取 10～20μl精液。
染色方法 精子形态分类
采用改良巴氏染色。实验方法见附2。
在100×油镜下及10×目镜分析200条带尾部的可辨认精子的形态。 计数百分率。报告四种类型缺陷：头部畸型、颈部和中段畸型、尾部 畸型、混合畸型。按照第四版精子形态分类标准，将所有形态学处于 临界状态的精子均列为异常。 在形态分类的同时如果见到许多尖头，需要单独记录。
② ③ ④
上游法
目的：
利用活动精子具有主动游过液体界面进入不同培养液 的能力，而达到自行与死精，凝集精子，畸形精子和 细胞杂质分离。 适用于正常精液\液化不良精液。
方法：
① ② ③
液化精液1：3加入培养液，离心200g×8’，洗涤2次。
留沉淀加入0.5ml培养液，制成精子悬液。
取另一支试管加入1ml培养液，将0.5ml精子悬液慢慢 加入试管底部，形成上下二个两面。
精子活力分级:a，快速直线前向运动；b，慢或缓慢的前向运动； C，非前向运动；d，不活动精子。
意义: 能够提供精子寿命和存活情况. 前向运动的精子可排除宫颈因素作为不育原因的可能性。
简化的玻片试验
将一滴宫颈粘液置于载玻片上，用盖玻片铺平。 载玻片两侧各滴1滴精液，使其与盖玻片边缘接触，借助于毛 细作用使精液移向盖玻片下，在宫颈粘液与精液之间形成一 个清晰的接触界面。 该载玻片置于湿润的温箱内，37孵育30分钟
精子形态分析时，同时计数非精子细胞成份，包括未成熟精细胞和白细 胞等。按下列公式计数精液中的非精子细胞密度。
C= N×S 100 N= 计数100个精子相同视野中一种特定细胞类型的数目。 S= 精子细胞密度（106 / ml）。 C= 特定细胞类型密度（106 / ml）。
精子—宫颈粘液相互作用检测
体内试验（性交后试验）PCT
1. 时间选择 在排卵期进行。 2. >2天避免性生活,性交后9—12小时进行试验. 3. 在阴道后穹窿部吸取混合样本及用另一个注射器或导管 吸取宫颈管内的粘液标本。 4. 将这些标本置于载玻片上，加盖玻片，显微镜观察 结果观察 性交后9—12小时进行
精液变量的术语：
正常精子状态
射出的精液符合参考值
少精子症 精子浓度低于参考值 (精子密度<20×106／ml或总精子数<40×106/一次射精) 弱精子症 精子活力低于参考值(a+b级<50％或a级<25 ％) 畸精子症 具有正常形态的精子少于参考值(正常形态 <15%) 少、弱、畸精子症 表示3种变量均异常（两种变量异常时，可 用两个前缀） 无精子症 所射精液中无精子 无精液症 不射精