电镜样品制备

透射电镜细胞样品制备技术和观察方法

(一)原理

透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片)。为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。

超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染色等。细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题。新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题，把薄膜放在培养瓶皿中，让细胞直接长在塑料薄膜上，不仅细胞生长效果好，而且可与细胞一起包埋切片，省去了许多麻烦。

(二)超薄切片基本操作步骤

试剂和器具准备：

（1）0.2 mol/L PBS

A液：磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）35.61g加双蒸水溶解至1000ml。

B液：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21g加双蒸水溶解至1000ml。

（2）2.5%戊二醛（C5H8O2）固定液：25%戊二醛10ml，0.2mol/L PBS 50ml，加双蒸水40ml。

（3）1%四氧化锇（OsO4）固定液

1）2%储存液：取1g OsO4 安瓿泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30mins。干后用玻璃刀刻划1或2道痕，置入棕色磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静止48h OsO4溶解后备用。4℃避光保存。

2）1%使用液：取2% OsO4储存液10ml，加0.2M PBS 10ml混合。

（4）不同浓度的乙醇溶液：用无水乙醇稀释成95%，85%，70%，50%，30%的乙醇。（5）环氧树脂Epon812包埋剂（Luft）：

A液：Epon812 612ml，DDSA 10 ml。

B液：Epon812 10ml，MNA 8.9 ml。

使用时根据不同硬度要求按一定比例（1:1~1:9）混合，A液多，则软。AB液混匀后，逐滴加入DMP-30，其浓度控制在1%~2%。边加边搅，充分搅拌30min左右。

（6）乙酸铀染液：乙酸双氧铀UO2（C2H3O2）2·2H2O（uranium acetate）溶于50%-70%乙醇溶液中至饱和，静置1-2天，使未溶解的部分沉淀，取上部黄色透明溶液用，避光保存。（7）柠檬酸铅溶液

1）A液：Pb（NO3）2（必须为新进产品）1.33g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）1.76g，双蒸水（用前加热沸腾后冷却）30ml，充分摇匀，混悬液为乳白色柠檬酸铅铬合物。

2）B液：NaOH 1mol/L。

3）使用液：A液配置完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮（pH=12）。如有沉淀，离心后再用。最多保存半年。

（8）铜网：细胞样品用250目，纳米材料用300-400目。

有支持膜的铜网400元/100片；无支持膜的铜网50元/100片。

1、取材

(1)离心法适用于悬浮生长细胞或单层生长细胞，欲观察细胞内部超微结构，取对数生长期的细胞低速离心，令细胞沉于锥形离心管底部，吸除上清液，立即加100ul 2.5%戊二醛固定。

(2)原位法将无菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包装的成品)剪成适宜的小块置入培养瓶中，然后接种细胞悬液，待细胞附于薄膜上并生长后，取出进行固定。

2、固定

将离心管中的细胞团块（约0.5mm*0.5mm*1mm）移入1.5ml EP管中，在4℃用0.1M PBS 漂洗3次，每次10分钟。再用1% 四氧化锇在4℃固定30分钟，接着用PBS漂洗3次。

3、脱水

用系列丙酮在室温下脱水。

30% 乙醇溶液1次，5-10分钟。

50% 乙醇溶液1次，5-10分钟。

70% 乙醇溶液1次，5-10分钟。

85% 乙醇溶液1次，5-10分钟。

95% 乙醇溶液1次，5-10分钟。

100% 乙醇溶液2次，每次5-10分钟。

100% 丙酮溶液2次，每次5-10分钟。

4、浸透

吸弃瓶中脱水剂，加3mL纯丙酮-EPON812包埋剂(1:1体积比)，室温下放置30分钟后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1mL，室温放置2小时或过夜。

5、包埋

(1)细胞团块吸取混合包埋剂滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘烤2小时，使之固化成硬块。

(2)细胞薄膜将预先干燥的EPON明胶囊注满混合包埋剂，倒盖在单层细胞上，在60℃固化24小时。

6、修块将包埋块安装在特制的夹具上，在显微镜下用单刃刀片修整去除表面的包埋剂，并做记号以便定位。

7、切片先将包埋块固定在超薄切片机上，切厚约1μm的半薄切片，用苏木素-伊红染色法染色。镜下观察细胞图像，确定进行超薄切片的部位，并作标记。准备φ3mm，150～200目的铜网，用清洗液清洗，并用无水乙醇脱水干燥。制备好支持膜，小心放在铜网上。在超薄切片机上安装三角形玻璃刀，固定包埋块，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛笔挑选切片并用钢丝环套取切片，贴在铜网有支持膜的一侧，保存在干燥器皿中待染色。

8、电子染色：用一干净培养皿，内放干净的牙科石蜡片。在石蜡片上加1至数滴醋酸铀染色液，用镊子夹住载网边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿染色5～30分钟，染色后尽快用双蒸水清洗三次。用滤纸吸去载网多余的水分，置培养皿内自然干燥。再将载网放在另一只备有蜡片的培养皿中以同样方法进行柠檬酸铅的染色及清洗。片染后凉干待观察。

培养细胞的TEM样品取材方法

1．观察培养细胞，确定细胞数量≥105，确定最佳取样时间；