第三章 酶催化反应动力学

米氏方程的双倒数作图
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
Vmax[S] V= Km+[S]
两边同取倒数 Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax
（林－贝氏方程）
-1/Km
1/V
0
1ຫໍສະໝຸດ Baidu[S]
V
3 酶浓度对反应速度的影响
+S
E －S ES
+
E
P
+S
EI － S ESI
图3-6 非竞争性抑制曲线
特点： ⑴ Vm值降低，Km值不变；Vm随[I]的增加而降低； ⑵ 双倒数作图所得直线相交于横轴； ⑶ 抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑 制程度无影响；抑制程度取决于抑制剂的浓度。
举例：
这类抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的
4.2 不可逆的抑制作用
根据不可逆抑制剂选择性的差异，通常把不可
逆抑制剂分为两种类型，即非专一性不可逆抑
制剂和专一性不可逆抑制剂。
①非专一性不可逆抑制剂
非专一性
有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物 重金属盐 烷化剂 硫化物、氰化物和CO
机理
与丝氨酸羟基共价结合 与半胱氨酸的巯基共价结合 使酶蛋白变性 与酶多个必须基团结合
与酶中金属离子形成稳定络合物 与糖肽转肽酶丝氨酸羟基结合
青霉素
举例1：有机磷化合物对羟基酶的抑制
RO P
X + E OH
RO P
O E
+ HX 酸
O R'O 有机磷化合物 羟基酶
+
O R'O 磷酰化酶 CHNOH
N
有机磷化合物 羟基酶 解毒 -- -- -- 解磷定 (PAM)
CH3 解磷定
单位是mol/L。
。
Vmax [S] V ( Km [S])
Km值的推导： Vmax 2
＝
Vmax[S] Km + [S]
Km＝[S]
Vmax [S] V ( Km [S])
米氏常数的应用价值
① Km是酶的一个特征性常数：也就是说Km的大小只与 酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。 ② Km值还可以用于判断酶的专一性和天然底物，Km值 最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天然底物。 ③ Km 可以作为酶和底物结合紧密程度的 — 个度量指标， 用来表示酶与底物结合的亲和力大小。 ④ 已知某个酶的 Km 值，就可以计算出在某一底物浓度 条件下，其反应速度相当于Vmax的百分比。 ⑤ Km值还可以帮助我们推断具体条件下某一代谢反应 的方向和途径，只有 Km 值小的酶促反应才会在竞争 中占优势。
个数学方程式称为米氏方程：
[S]：底物浓度 V ：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
Vmax [S] V ( Km [S])
米氏常数Km的含义
Km 值就代表着反应速度达到最大反应速度 一半时的底物浓度，
影响因素 （1）底物浓度
目的和意义 酶 促 反 应 速 度
找到适宜的反应条件提 高或抑制酶催化反应效率 了解酶在生理代谢过程 中的作用和某些药物的作 用机制等
（2）酶浓度
（3）抑制剂 （4）温度 （5） pH
（6）激活剂
1酶催化反应速率与酶活力的测定
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，其大小 可以用在一定条件下该酶所催化的某一化学反应 的反应速度（reaction velocity）来表示，酶活 力的高低和化学反应的反应速度的大小两者呈线 性关系。
测定产物增加量
测定酶活力
的基本原理
测定酶活力常 用的方法：
测定底物减少量
1.3酶活力测定时需注意：
（1）选择反应的最适温度，根据不同的底物和缓
冲液选择反应的最适pH。
（2） 速度要快，取反应的初速度
（3） 底物浓度要足够大（一般在10Km以上）
使酶被底物饱和，以充分反映待测酶的活力
2 底物浓度对酶促反应速度的影响
- 抑制剂复合物 ESI ，与非竞争性抑制相似， 这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复 合物ESI不能进一步分解产生产物，因此相应 的酶促反应速度下降。
反竞争性抑制反应模式
反竞争性抑制的特点是，酶(E)必须先与底物 (S)
结合，然后才与抑制剂(I)结合，即抑制剂(I)与酶
- 底物复合物 (ES) 的结合是可逆的，因此存在着 如下的化学平衡式：
如何避免影响？
测定反应初速度的方法来测定相关制剂中酶的含量（活性）。
1.2 酶活力的测定原理
酶蛋白的含量很低，很难直接测定其蛋白质的 含量，且常与其他各种蛋白质混合存在，将其 提纯耗时费力。故不能直接用重量或体积等指 标来衡量。
分光光度法 荧光法 同位素法 电化学方法 其他方法：如旋光 法、量气法、量热 法和层析法等
是否可逆，我们可以将抑制作用分为两大类，即：
不可逆的抑制作用(irreversible inhibition)
可逆的抑制作用(reversible inhibition)
不可逆抑制作用
抑制剂与酶的必需基团以 共价键的形式结合而引起酶 活力降低或丧失。 是不可逆的。 本质上来说就是酶的修饰 抑制
+
N CH3
E OH O OR' P CHNO OR
举例2：有机砷对巯基酶的抑制
SH E SH + Cl Cl As H C S CHCl E S As H C CHCl + 2HCl
巯基酶
路易士气
H2C SH SH E SH
失活的酶
H2C S + HC S H2C OH
酸
S E S
H As C CHCl + HC SH H2C OH
举例：磺胺类药物的抑菌机制
•与对氨基苯甲酸竞争性抑制二氢叶酸合成酶
Glu + H2N COOH PAB A + 二氢蝶呤
FH2合成酶
FH 2
FH2还原酶
FH 4
氨甲蝶呤 H2N 磺胺药 SO2NHR
②非竞争性抑制(noncompetitive inhibition) ： 非竞争性抑制剂(I)和底物(S)可以同时与酶(E) 结合，两者之间不存在竞争关系。 但是在酶与抑制剂结合后，还可以进一步与底 物结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI；酶与 底物结合后，也可以进一步与抑制剂结合形成 酶-底物-抑制剂复合物ESI。
鉴别
鉴别方法
（1）能否用透析、
可逆抑制作用
•由于抑制剂与酶以非共价键
如 何 鉴 别 ？
超滤和凝胶过滤等 物理方法除去抑制
剂？
（2）化学动力学的 方法（见下图）
的形式结合而引起酶活力降低
或丧失。 是可逆的。
图3-4 可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一） 曲线1，无抑制剂；曲线2，不可逆抑制剂；曲线3，可逆抑制剂
研究抑制剂的意义
（1）是研究酶的结构与功能、酶的催化机制以及 阐明机体代谢途径的基本手段。 （2）可以为医药产业中设计新药物和农业生产中 设计新农药提供重要的理论依据。 （3）在食品生产和保鲜中控制酶的催化效率。
4.1抑制作用的类型及鉴别
根据抑制剂与酶的作用方式的区别以及抑制作用
第三章 酶催化反应动力学（2学时）
主要内容： 1
酶催化反应速率与酶活的测定
底物浓度对酶促反应速度的影响 酶浓度对酶促反应速度的影响 抑制剂对酶促反应速度的影响 其它因素对酶促反应速度的影响
2 3 4 5
重 要
酶催化反应动力学研究包括哪些内容 ?
定义：酶催化反应动力学是研究酶促反应速度 以及影响此速度的各种因素的科学。
2.1中间络合物学说
中间络合物学说最早是由 Henri和Wurtz两位科学家 提出的。 在 1903 年， Henri 在用蔗 糖酶水解蔗糖实验研究化 学反应中底物浓度与反应 速度的关系时发现，当酶 浓度不变时，可以测出一 系列不同底物浓度下的化 学反应速度，以该反应速 度对底物浓度作图，可得
竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制
①竞争性抑制(competitive inhibition) ：
是最常见的一种可逆抑制作用。 大多数竞争性抑制剂与底物的结构相似，能与 底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合 物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称
为竞争性抑制作用。
其抑制程度取决于底物和抑制剂的相对浓度， 可以通过增加底物浓度的方法来解除这种抑制 作用。
竞争性抑制反应模式
在竞争性抑制中，底物(S)或抑制剂(I)与酶(E)的
结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：
[S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制
图3-5 竞争性抑制曲线
特点：
⑴ Vm值不变，(表观）Km值增大； ⑵ Km随抑制剂浓度[I]的增加而增加； ⑶双倒数作图所得直线相交于纵轴； ⑷抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除。
相似化学结构
b) Kat 型不可逆抑制剂：不但具有与天然底物 相类似的结构，而且抑制剂本身也是酶的底物， 专一性极高，因此也被称为自杀性底物。
例如：β-卤代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的不可逆抑制剂
4.3 可逆的抑制作用
根据可逆抑制剂与底物的关系，我们将可逆抑制
作用分为三种类型。
1 2 3
H As C CHCl
失活的酶
BAL
巯基酶 BAL与砷剂结合物
砷化合物 巯基酶 解毒 -- -- -- 二巯基丙醇(BAL)
②专一性不可逆抑制剂
a) Ks型不可逆抑制剂：具有与底物相类似的结
构
例如：对甲苯磺酰 -L- 赖氨酰氯甲酮（ TLCK ）和胰蛋
白酶的底物对甲苯硫磺-L-赖氨酰甲酯（TLME）具有
当[S]＞＞[E]，酶可被底 物饱和的情况下，反应速 度与酶浓度成正比 关系式为： V = K3[E]
0
[E] 当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
酶浓度对反应速度的影响
E+S
k1 k2
ES
k3
E+P
4 抑制剂对酶促反应速度的影响
酶的抑制剂 (inhibitor) ：凡能使酶的催化活 性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的 抑制剂。 区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性
一种非竞争性抑制剂。
有某些重金属离子如 Ag + 、 Cu 2 + 、 Hg 2 + 、
Pb2+等对酶的抑制作用也属于这一类。 EDTA对金属酶的抑制。
③反竞争性抑制(uncompetitive inhibition) ：
这类抑制作用的特点是只有在酶(E)与底物(S)
结合后，才能与抑制剂(I)结合，形成酶-底物
1.1酶催化反应速率随时间的变化
酶催化的反应速度
可用在单位时间内
底物的减少量或者 产物的增加量来表 示。如图 3-1 所示 的曲线图。 酶促反应速度随反 应时间延长而降低。 图3-1 酶促反应的速度曲线
引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因？
（ 1 ）底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆 反应的进行； （2）产物对酶的抑制作用； （3）随着反应时间的延长引起酶的部分失活等。
E
+
S
ES
ESI
E
+
P
图3-7 反竞争性抑制曲线
特点： ⑴ Vm值和Km值都随[I]的增加而降低； ⑵ 双倒数作图所得为一组平行线； ⑶必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程 度随底物浓度的增加而增加。
举例：
这种抑制作用在单底物反应中比较少见，而常
见于多底物反应中。
目前已经证明，肼类化合物对胃蛋白酶的抑制
图3-2 底物浓度对酶促反应速度的影响
到如图3-2所示的曲线。
酶底物中间络合物学说
根据这一实验结果，Henri和Wurtz提出了酶促化
学反应的酶底物中间络合物学说。该学说认为：
当酶催化某一化学反应时，酶(E)首先需要和底物
(S)结合生成酶底物中间络合物即中间复合物
(ES) ，然后再生成产物 (P) ，同时释放出酶。该
这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复
合物ESI不能进一步分解产生产物，因此相应 的酶促反应速度下降。
非竞争性抑制反应模式
在非竞争性抑制中，抑制剂 (I) 与酶 (E) 或酶 - 底物复合物 (ES)以及底物(S)与酶-抑制剂复合物(EI)的结合都是可逆 的，因此存在着如下的化学平衡式：
学说可以用下面的化学反应方程式来表示：
k1 k2 k3
E+S
ES
E+P
酶底物中间络合物学说
酶已全部被底物所饱和
酶还未被底物所饱和
2.2 酶促反应的动力学方程式（米氏方程）
1913年Michaelis和Menten两位科学家在前 人工作的基础上，根据酶促反应的中间络合物 学说，推导出一个数学方程式，用来表示底物 浓度与酶反应速度之间的量化关系，通常把这