乌梢蛇质量标准及检验操作规程

XXXXXX有限公司成品质量标准及检验操作规程

1 品名：

1.1 中文名：乌梢蛇

1.2 汉语拼音：Wushaoshe

2 代码：

3 取样文件编号：

4 检验方法文件编号：

5 依据：《中国药典》（2015年版一部）。

6 质量标准：

7 检验操作规程：

7.1 试药与试剂：无水乙醇

7.2 仪器与用具：电子天平、生物显微镜、水浴锅、干燥箱、离心机、

7.3 性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。

7.4 鉴别：

7.4.1 乌梢蛇乌梢蛇肉取本品制片置10×10显微镜下做显微观察。

7.4.2 酒乌梢蛇聚合酶链式反应法。

模板DNA提取取本品0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取0.1g置1.5ml离心管中，加入消化液275μl[细胞核裂解液200μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液50μl，蛋白酶K（20mg／m1）20μl，RNA酶溶液5μl]，在55℃水浴保温1小时，加入裂解缓冲液250μl，混匀，加到DNA纯化柱中，离心（转速为每分钟10000转）3分钟；弃去过滤液，加入洗脱液800μ1[5mol/L

醋酸钾溶液26μl，1mo1／L Tris-盐酸溶液（pH值7.5）18μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液（pH值8．O）3μl，无水乙醇480μl，灭菌双蒸水273μl]，离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱3次，每次离心（转速为每分钟10000转）1分钟；弃去过滤液，再离心2分钟，将DNA 纯化柱转移入另一离心管中，加入无菌双蒸水100μ1，室温放置2分钟后，离心

（转速为每分钟10000转）2分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下20℃保存备用。另取乌梢蛇对照药材0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

PCR反应鉴别引物：5'GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3'

和5'CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’。PCR反应体系：在200μl 离心管中进行，反应总体积为25μl，反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP （2.5mmol/L）2μl，鉴别引物（l0μmol/L）各0.5正，高保真Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板0.5μl，无菌双蒸水18.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟，循环反应30次（95℃30秒，63℃45秒），延伸（72℃）5分钟。

电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法（通则0541），胶浓度为1%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为2μl（0.5μg/μl）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300～400bp应有单一DNA条带。

7.5 浸出物: 乌梢蛇乌梢蛇肉照醇溶性浸出物测定法（通则2201）项

下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于12.0 %。