实验七、GUS组织化学定位

完成实验报告
第2周：移液器的使用及聚合酶链式反应（PCR) （实验报告1） 第3周:质粒DNA的提取（实验报告2） 第4周: PCR产物与质粒DNA的检测 第5周: 质粒DNA的酶切及凝胶电泳检测（实验报告3） 第6周：质粒DNA的连接及凝胶电泳检测（实验报告4） 第7周：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化（实验报告5） 第8周：GUS组织化学定位（实验报告6）
转基因作物的检测方法
（一）以载体为检测对象：PCR扩增载体序列，根据扩 增产物的大小或有无来判断是否为转基因植物。 目前, 瑞典等欧洲国家普遍以35S 的检测结果作为转基因 食品标签的重要依据。 （二）以插入的外源基因为检测对象：PCR扩增插入的 外源基因；或者利用抗体与抗原的反应来检测（Western blotting，ELASA等）。 （三）以插入的报告基因为检测对象：GUS染色法。
• 37度培养12-14h，会长出如上图所示的单 菌落（乳白色、浑圆、饱满、菌落高度明 显突出培养基表面）。
• 培养时间过长，比如超过16小时，在这些 单菌落周围会出现一小密集的像针尖一样 大小的菌落，称为卫星菌落。这说明，培 养的时间太长了。
卫星菌落
• 有些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它 可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶 积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒 的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。
本实验材料中使用的转基因载体的部分图谱
克隆拟南芥中的AK12基因的启动子，插入到 PBI101载体GUS基因上游的克隆位点（具体图 示如下）
农杆菌转化
转化拟南芥
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
PBI101载体
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
花椰菜花叶病毒( CaM V)启动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
本实验基本流程
拟南芥AK12-pro 种子萌发，长成幼苗
取幼苗 组织化学检测 -- GUS检测
➢ 由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背 景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的 研究中（作为报告基因）。根据gus基因检测所用 的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学 法、分光光度法和荧光法（灵感度为分光光度检 测法最高），其中最为常用的是组织化学法。
• 组织化学法检测：以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷 酸酯（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有 底物的缓冲液浸泡，若组织细胞被转入了GUS基 因，并表达出Gus，在适宜的条件下，该酶就可将 X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧 化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的 部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到 ，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性 。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、 组织，甚至单个细胞内的表达情况。
• 只要知道启动子在什么部位表达，就可以推 测出该启动子所启动的基因的表达部位。
• 启动子的表达如何才能肉眼可见呢？——连 接报告基因（GUS,分解底物呈蓝色）。
• 基因的组织特异性表达
原理
➢ GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因 ，它存在于 E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。 β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯 类物质为底物，其分解产物呈蓝色。
蓝白斑筛选的原理（ α-互补）
蓝白斑筛选的原理（ α-互补）
现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列 和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（ MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。 这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（ β-半乳糖苷酶）活性，但它 们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。
肉眼下观察染色情况；拍照。如果有GUS基因表达产物，则出现蓝 色。
实验报告
转基因作物的检测
新霉素磷酸转移酶II(nptⅡ )基因（卡那霉素抗性）
AK12- pro RB 35S-pro NPT П NOS-ter
GUS
NOS-ter LB
pBI101
花椰菜花叶病百度文库( CaM V)启动子 nopaline synthase(NOS)gene 终止子 胭脂碱合成酶
完成实验报告
• 以分析失败的可能原因为主！
实验七、转基因植物中报告基因 GUS组织化学定位检测
如何检测基因的组织特异性表达？
• 基因的组织特异性表达主要是由该基因特异 性启动子决定的。即，某些启动子有组织特 异性，它会启动该基因的特异性表达。
• 启动子没有基因特异性，它会启动任何下 游基因的表达。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物 X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质 粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段， 使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白 斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养1216hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
➢ 组织化学染色检测 -- GUS染色 1. 取2支1.5ml离心管，各加入0.3ml 1mol/L GUS染色液； 2. 用镊子夹取 转基因和野生型拟南芥幼苗各1根，分别放入上述离心
管中； 3. 37℃浸泡过夜（5h）；（下午或晚上继续下面的脱色和照相步骤） 4. 倒掉染色液，加入75%乙醇脱色；30min后换一次75%乙醇脱色；
考核
成绩计算方法（百分制）： 期末考试: 40分，40%*100 （与分子生物学理论课一起考试，两份卷子;考试内
容包括平时操作和涉及实验的理论基础） 平时成绩: 60分，60%*100
报告基因GUS的表达的检测
➢ 材料：拟南芥AK12-pro ➢ 试剂：
GUS工作液：在450mlddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚 铁氰化钾，50ml 1mol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0），加水至500ml， 4℃储存备用。1mol/LGUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc， 再加入GUS工作液，定容至100ml，分装成小管，置于-20℃储存备 用。