肠杆菌检验程序(详细版)
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肠杆菌科
【器材】
一、SS平板培养基:选择性培养基,有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂.
1、煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长,胆盐促进伤寒生长。
2、大肠分解乳糖产酸:中性红(6.8红-8.0黄)变红,与胆盐结合合成胆酸,因而形成中心混浊的深红色菌落,病原菌不分解乳糖,故菌落呈透明微黄色。
3、枸橼酸铁能指示硫化氢产生,硫化铁呈黑色
4、硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用,并中和煌绿、中性红染料的毒性,使大肠红色鲜明
二、KIA斜面培养基:用酚红作指示剂(6.8黄-8.4红)。上层为固体琼脂斜面,含乳糖。下层为半固体琼脂,含葡萄糖,含硫酸亚铁。
1、细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气,则斜面及底层均呈黄色,且有气泡。非致病菌(如大肠埃希菌)一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖,但肺克也是如此。
2、如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖,因葡:乳为1:10,斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发,从而使斜面部分保持原来的红色;底层则是在相对缺氧的状态下,所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。致病菌一般不能利用乳糖,可用于区别致病/非致病菌。
3、如细菌分解蛋白质产生硫化氢,则与硫酸亚铁反应生成硫化亚铁(黑色沉淀物),使培养基变黑。
左:不发酵乳糖,强产硫化氢。中:不发酵乳糖,不产硫化氢。右:发酵乳糖,不产硫化氢
4、接种方法:先穿刺到底,再在斜面划线。
【实验内容】
一、氧化酶试验
原理:见奈瑟菌属部分
操作:取氧化酶纸片,刮去KIA或普通平板或普通平板上的较大菌落,观察纸片颜色的变化,呈蓝紫色为阳性,不变为阴性(如试剂为盐酸二甲基对苯二胺,阳性者则为红色)。肠杆菌科多为阳性(但变形杆菌为阴性)。
注意事项:因SS培养基中的化学成分和生化反应复杂,其菌落可使滤纸变为紫红色,故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶试验时,宜从普通平板或KIA斜面上取菌,以保证试验结果正确。
二、动力试验:
原理:有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。
培养基:半固体培养基
方法:分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,37 ℃孵育16-18h
结果:穿刺线扩散,培养基透明度减低为动力阳性;穿刺线清晰,培养基透明为动力阴性。本试验,大肠为(+),肺杆为(-)
三、吲哚试验:(靛基质试验)
原理:有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚,与对二甲基氨基苯甲醛形成红色化合物。
培养基:蛋白胨水
方法:将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中,37 ℃孵育16-18h
结果:取出后,滴加吲哚试剂2d,混匀,可见培养物上层呈玫瑰红色为+,不变色为-。本试验,大肠为(+),伤寒为(-)
四、尿素酶试验:
原理:产生尿素酶的细菌能分解尿素,形成氨,使培养基呈碱性,酚红指示剂变成红色。
培养基:尿素培养基
方法:将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中,37 ℃孵育16-18h
结果:培养基变红色者为阳性。变黄为阴性。本试验,大肠为(-),变形为(+)
五、甲基红试验:
原理:某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等,故培养物pH在4.5以下,加入甲基红指示剂后呈红色。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质,如醇、酮等,培养基pH在6.2以上,加入甲基红指示剂呈黄色。
培养基:葡萄糖蛋白胨水
方法:分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌
结果:加入甲基红指示剂2d,混匀,红色为阳性,黄色为阴性。本试验,大肠为(+),肺杆为(-)六、苯丙氨酸脱氨酶试验:
原理:某些细菌(如变形杆菌属),可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸,加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成绿色化合物。
培养基:苯丙氨酸琼脂培养基
方法:分别接种大肠埃希菌和变形杆菌,37 ℃孵育16-18h
结果:滴加100 g/L三氯化铁试剂,出现绿色为+,不变为-。本试验,变形为(+),大肠为(-)
七、柠檬酸盐利用试验:
原理:当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源,同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时,可在柠檬盐培养基上生长,并分解柠檬酸盐为碳酸盐,使培养基变碱,指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色,为柠檬酸盐利用试验阳性。若不能利用则不能生长,培养基不变色,为阴性。
培养基:西蒙柠檬酸盐培养基
方法:分别接种大肠埃希菌和变形杆菌,37 ℃孵育16-18h
结果:大肠-(绿色),变形+(蓝色)
八、总结:结果判断与观察
KIA:观察上部和下部的颜色变化,变黄为产酸,变红为产碱,有气泡为产气,有黑色为产硫化氢。动力(M):半固体上沿穿刺线生长,周围清澈,为阴性,周围混浊者为阳性。
吲哚(I):在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3滴,立刻变红者为阳性,不变为阴性。
尿素酶试验(U):变为深粉红者为阳性,不变或变黄者为阴性。
甲基红试验(Mr):在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3滴,变红为阳性,变黄为阴性。
枸橼酸盐利用试验(C):细菌在上生长,颜色变为蓝色为阳性,细菌不长或培养基颜色不变为阴性。苯丙氨酸酶试验:在斜面上滴加10%FeCl3试剂2-3滴,变成暗绿色为阳性,不变为阴性。
菌种
KIA MIU
甲基红
(Mr)
枸橼酸
盐(C)
苯
丙
氨
酸斜面底层产气硫化氢动力吲哚脲酶
大肠埃希菌 A A + - + + - + - - 福氏志贺菌K A -/+ - - +/- - +/- - - 宋内氏志贺菌K A -/+ - + - - +/- - - 伤寒沙门氏菌K A - +/- + - - + +/- - 甲型副伤寒菌K A + -/+ + - - + - - 乙型副伤寒菌K A + + + - - + + - 肺炎克雷伯菌 A A + - - - + - + - 变形杆菌K A + + + + + + +/- + 【其他试验】
一、大肠埃希菌
1、形态结构观察:革兰阴性、中等大小、两端钝圆、多呈单个散在分布的杆菌。鞭毛染色为周毛菌
2、菌落观察:在普通琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落;在血琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落,某些菌株有β溶血;在SS琼脂平板上呈红色、圆形、凸起、边缘整齐的菌落,多数为光滑型菌落。
二、志贺菌属
1、形态结构观察:为格兰阴性杆菌,散在分布,多无鞭毛
2、菌落观察:在SS和MAC平板上形成无色透明、中等大小的菌落,除宋内氏志贺菌外,菌落均为光滑型。
3、血清学试验:凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。
①方法:取一环志贺菌四种多价血清与载玻片一端,再取少许待测菌与之混合,同时在玻片另一端取待测菌与之混合,同时在另一端取待测菌与生理盐水混合对照。
②结果判定:对照呈均匀浑浊,待检菌与志贺菌四种多价血清混合后,数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A/B/C/D群最常见的单价血清凝集定种。
③报告:分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。经分离鉴定后符合鉴定依据者,可报告“分离出XX志贺菌”,若进一步做多种生化反应及因子血清分型后,可报告“分离出XX志贺菌X型”。
二、伤寒沙门菌属
1、形态结构观察:沙门菌属为革兰阴性细长杆菌,鞭毛染色可见周鞭毛。
2、菌落观察:在SS和MAC平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落,产硫化氢的菌种可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。