植物组培2-愈伤组织的诱导

植物组织培养-愈伤组织的诱导
一、【实验目的】
掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。

二、【实验原理】
植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。

植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。

而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。

植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。

超净工作台工作原理：
本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备
室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境
三、【实验仪器和材料】
仪器：培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸
试剂：乙醇、2 ，4 – D （生长素类似物）、次氯酸钠、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）、MS 培养基、0.1 mol/L NaOH 与0.1 mol/L HCl
材料：绿豆、胡萝卜、自选材料
四、【实验步骤】
（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。

（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。

（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。

（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。

（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。

（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。

（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。

（9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下（烟草可用弱光），20天左右外植体逐渐膨大形成愈伤组织，愈伤组织的形成标志着接种的外植体已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。

无菌器皿、用具的准备：
将解剖刀及镊子放入95%的酒精中浸泡片刻，用干棉球蘸取95%的酒精擦拭盘子、解剖刀及镊子，将酒精挤在盘子上，然后引燃火，（引火棉球立即放入培养皿中加盖熄火）使盘子、解剖刀及镊子灼烧后冷却。

五、【实验结果及讨论】
实验选择了绿豆和萝卜作为实验材料，切块放在一个培养瓶中培养，其中萝卜组织共六块（3mm×3mm×3mm）,绿豆组织共两块（2mm×2mm×2mm），实验现象如下
一周后：有些萝卜组织表层出现少量愈伤组织，开始了脱分化；绿豆组织没有明显脱分化现象出现。

两周后：萝卜组织表层组织进一步脱分化，愈伤组织较一周前有增多，组织块颜色变浅，有白化趋势；绿豆组织仍不明显，或不易用肉眼观察。

三周后：所有萝卜组织表层都脱分化成为愈伤组织，但量少，组织颜色进一步白化，变为淡肉色；绿豆组织脱分化现象仍不明显。

若干周后：所有萝卜组织表层的脱分化进行缓慢，几乎保持不变，而颜色也逐渐变淡，但仍然变化缓慢；绿豆组织仍不明显或不能用肉眼分辨。

相关图片如下：
萝卜愈伤组织
绿豆
萝卜愈伤组织
萝卜愈伤组织
萝卜愈伤组织
六、【实验注意事项】
1、所有的东西都要即时标记好，日期，名称，浓度等(标注可以组别-姓名，如1-姓名或1-姓名单字母缩写）
2、自己用过的器皿要自己洗刷，并灭菌，以备下组同学使用。

3、实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。

七、【思考题】
1. 以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他
现象。

并简述本人的培养结果或现象。

答：我组共十人，统计结果如下
污染6人，愈伤组织明显2人，愈伤组织不明显2人
本人培养的植物组织块较小，仔细观察萝卜块，能看到表面有愈伤组织形成，但不太明显，绿豆块脱分化及不明显，几乎不能分辨其上的愈伤组织。

分析原因：
1、可能由于所切的组织块太小导致在实验操作中部分未洗净的次氯酸钠抑制了脱分化现象，导致了愈伤组织不明
显。

2、可能由于所取的萝卜组织块处于分裂不旺盛的区域导致脱分化现象缓慢，实验应取分裂旺盛的分生区细胞。

3、实验要求应有光照培养，但实际培养过程中却并没有光照条件，这可能是脱分化缓慢的主要因素。

2.你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？
答：植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染，如果受到污染则组织就不能正常生长分化，则实验失败。

在具体实验操作中我们还应注意：
（1）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
（2）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服等；
（3）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处，然后搽拭工作台面；
（4）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（5）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
（6）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。