植物根系活力的测定

植物根系活力的测定（TTC法）

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。

一、原理

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80 mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲（TTF），如下式：

C

N N

N+ Cl-C

N N

H

N N

+ HCl

TTC（无色）TTF（红色）

生成的三苯甲（TTF）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

水培或砂培小麦、玉米等植物根系。

（二）试剂

1. 乙酸乙酯（分析纯）。

2. 次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯），粉末。

3. 1％TTC溶液：准确称取TTC 1.0 g，溶于少量水中，定容到100 mL。用时稀释至需要的浓度。

4. 磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH7.0）。（配法：磷酸二氢钾9.08g定容至1L，无水磷酸氢二钠9.47g定容至1L（或Na2HPO4•2H2O 11.87g），再取磷酸氢二钠61.1ml和磷酸二氢钾溶液38.9ml定容至100ml）

5. 1 mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000 mL。

6. 0.4 mol/L琥珀酸(丁二酸)：称取琥珀酸4.72 g，溶于水中，定容至100 mL即成。

（三）仪器设备

小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5 mL 1支、10 mL 1支、5 mL 3支，刻度试管6支，分光光度计，分析天平（感量0.1 mg），电子顶载天平（感量0.1 g），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。

三、实验步骤

1. 定性测定

（1）配制反应液把1％TTC溶液、0.4 mol／L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混

合。

（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1～3 h ，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

2. 定量测定

（1）TTC 标准曲线的制作 取0.4％ TTC 溶液0.2 mL 放入大试管中，加9.8 mL 乙酸乙酯，再加少许Na 2S 2O 4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF 。此溶液浓度为每毫升含有TTF 80 µg 。分别取此溶液0.25 mL 、0.50 mL 、1.00 mL 、1.50 mL 、2.00 mL 置10 mL 刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF 20 µg 、40 µg 、80 µg 、120 µg 、160 µg 的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比，在485 nm 波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.5 g ，放入小烧杯中，加入0.4％ TTC 溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5 mL ，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～2 h ，此后立即加入1 mol/L 硫酸2 mL ，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。

（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3～4 mL ，充分研磨，以提出TTF 。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2～3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL ，用分光光度计在波长485 nm 下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC 还原量。

四、结果计算

根系活力=1000

⨯⨯h W C [mg TTF/（g ·h ）]

式中：C ——四氮唑还原量，μg 。

W ——根重，g 。

h ——时间，h 。