第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质

六、聚乙烯醇系
聚乙烯醇系是以交联聚乙烯醇为骨架的凝 胶过滤介质，为多孔的三维网状结构，大分子 链上含有丰富的羟基，它不但使骨架为高亲水 性，还可利用羟基进行化学改性而得到含有多 种功能基的离子交换剂及亲和吸附剂。该系列 凝胶与生物大分子有较好的相容性。
七、Bio-Beads S-X 系
Bio-Beads S-X 系列是美国Bio-Rad公司的 产品，为多孔苯乙烯-二乙烯共聚物，其适用 于疏水性物质及非水体系。以二乙烯苯的含 量控制孔径，但孔径也受溶剂的影响，在芳 香族溶剂中，由于珠体有溶胀作用，其孔径 较大，排阻极限增大；若在醇类溶剂中骨架 不溶胀，孔径较小，排阻极限亦小。
第四节 离子交换法及离子交换剂 的选择
一、离子交换法
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离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂 中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。 该法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子 中电荷的微小差别而进行分离。 由于离子交换法分辨率高、工作容量大且易于操作， 它已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分 离纯化的一种重要方法，在生化分离中约有75%的 工艺采用离子交换法。
三、凝胶过滤介质的种类
1、多糖类骨架的介质 2、合成大分子骨架的介质 3、由天然大分子与合成高聚物构成混合骨 架的介质
1、多糖类骨架的介质
多糖类主要为纤维素、葡聚糖及琼脂糖等。以天 然多糖为母体的凝胶过滤介质是经典的分离生物 大分子的材料。 这类介质具有亲水性及与生物大分子的相容性， 可允许生物大分子透过而不发生变性。 这类介质原多为软基质，压力降大，不易操作， 近年来合成工艺不断改进，生产出刚性和半刚性 的骨架，出现了适合于高流速且具有高分辨率的 新产品，以满足生产规模的需求。
这种骨架即可增加介质的刚性及抗微 生物侵蚀性，又使介质具有与生物大分子 的相容性。
四、凝胶过滤应注意的事项
1、凝胶过滤通常上样量的体积小。 2、装柱是影响分离效果的重要步骤。 3、避免大分子与凝胶产生非特异吸附。 4、根据样品中组分的情况选取分离范围与 分子量相近的介质为好。 5、在应用过程中以分辨率、流速、耐用性 及蛋白的回收率全面评定介质的性能。
LH系列主要用途
1、用于有机溶剂中的凝胶过滤，尤其适用于 嗜脂性分子及制备各种天然产物。 2、它结合凝胶过滤、分配色谱及吸附层析 的特点，能分离结构非常相近的分子，适 用于其他凝胶难以处理的样品。 3、排阻极性与原母体凝胶相同。 4、此类介质的分离效果优良，负载量可高 达300mg/ml凝胶，且适用寿命长。
2、合成大分子骨架
吸取多糖类骨架亲水性的优点，克服其 易受微生物侵蚀的缺点，开展了合成有机大 分子骨架的研究，选用高亲水性单体，经共 聚反应并控制孔结构出现了一些合成骨架的 介质。除应用多年的聚丙烯酰胺类以外，20 世纪80年代还出现了聚乙烯醇系及含羟甲基 酰胺类的新介质，并已商品化。
3、由天然大分子与合成高聚物构 成混合骨架的介质
（2）化学稳定性 Sephadex不溶于一切溶剂，在 水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸溶剂中均较稳定。 因糖苷键在强酸中可发生降解作用，所以只能接触 强酸的稀溶液，在0.1mol/L盐酸中可接触1-2h，在 0.02mol/L盐酸中经6个月均无明显变化，要避免使 用氧化剂。 （3）物理稳定性 pH中性湿态球体可经受120度、 30min高压灭菌而不影响色谱性能。 （4）机械强度 Sephadex凝胶的机械强度取决于交 联度，高交联度的凝胶(G10，G15）为刚性，G25 及G50也能承受一定压力，这几种凝胶的流速均与 压力降成正比，服从Darcy定律。
四、Sephacryl 系列
是一类经济高效的凝胶过滤介质，它是 由烯丙基葡聚糖与N,N’亚甲基双丙烯酰胺经 共聚而成的一种共价交联的刚性珠体。
五、Superdex 系列产品
Superdex是最新的凝胶过滤介质。其结 构是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的 多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。它具有 葡聚糖及琼脂糖均匀组分的骨架结构，因此 其将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联 的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身，成为 具有优良选择性和高分辨率的产品。
第三节 凝胶过滤介质的主要种类
一、葡聚糖系 二、琼脂糖系 三、聚丙烯酰胺系 四、Sephacry1系列 五、Superdex系列产品 六、聚乙烯醇系 七、Bio-Beads S-X系
一、葡聚糖系
牌号：Sephadex 1、结构 Sephadex是以氯代环氧丙烷进行交联 的葡聚糖珠状凝胶，结构如图9-1所示。交 联程度决定凝胶的孔结构，依据孔径不同 形成G型凝胶的系列产品。
分离
1、选择适当条件使一些溶质分子变成离子 态，通过静电作用结合到离子交换剂上， 而另一些物质不能被交换，则这两种物 质被分离。 2、带同种电荷的不同离子虽都可以结合到 同一介质上，但由于各带电量不同，与 介质的结合牢度不同，改变洗脱条件可 依次被洗脱而达到分离的目的。
生物大分子的分离纯化
可采用两种方式：
3、主要用途
孔径较小的凝胶（如G10、G15、G25、 G50）主要用于脱盐、肽与其它小分子的分 离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分 子的分离。 DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚 核苷酸的分离。
4、衍生系
Sephadex LH系 在葡聚糖结构中引入羟丙基就成为LH系 产品。以G25为母体的衍生物为LH20，以 G50为母体则为LH60。 经改性后，LH系介质具有更广泛的用途， 适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素 及其他小分子的分级分离。这类介质除水溶 液外，还适用于极性有机溶剂及水-有机溶剂 的混合液中。
第九章 凝胶过滤及离子交 换层析介质
第一节 概述
液相色谱是分离纯化的一种重要方法，在多肽、蛋 白质及天然生物制品的分离纯化工艺中早已获得应用。 随着生物技术的发展出现了许多以柱层析为基础的 系统装置。1982年出现了快速蛋白质液相色谱系统 （FPLC）。 瑞典的Amersham Pharmacia 公司的Bioprocess系统
BioProcess 凝胶的主要特点是：
1、适用于实验室及大规模的工业生产，在 使用中有较高的重现性。 2、易于清洗、消毒及再生，介质的使用寿 命较长，具有优良的化学物理稳定性。 3、易于装柱，具有较高的动态工作容量， 流速较快，有利于工业生产。
在液相色谱中，无论是那一种层析方法， 分离介质的性能都是决定分离效果的首要因 素。经典的凝胶层析介质性能不断改进，已 成为具有高通透性、高分辨率、高机械强度 的新型凝胶过滤介质；具有新型功能基的离 子交换剂、螯合介质已用于生化领域；特种 离子交换剂-缓冲离子交换剂用于聚焦色谱， 亲和层析的基体种类日益增多。
一种方式是将目的产物离子化，被交换到 介质上，杂质不被吸附而从柱流出，称 为“正吸附”。 另一种方式是将杂质离子化后被交换，而 目的产物不被交换直接流出，这种方式 称为“负吸附”。
分类
按照操作方法：
1、间歇式分批操作：又叫静态处理，将离 子交换剂浸泡于工作液中达到平衡后滤 出介质进行洗脱。 2、柱式操作：又称动态法。交换、洗脱、 再生等步骤均在柱内进行，亦称为离子 交换色谱法。
离子交换剂是一类能显示离子交换功能的高分 子材料。功能基由骨架上的带电基团与可进行交换 的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以 静电力结合，可进行交换的离子称为反离子或抗衡 离子，这种反离子可与溶液中带同种电荷的离子进 行交换反应。 因此，离子交换反应是可逆的，在一定条件下 被交换的离子可以“解吸”使离子交换剂又恢复到 原来的离子形式。
凝胶过滤
主要有脱盐与分级分离两大用途：
脱盐是分离大小两类不同的分子即无机 盐与生物大分子的分离。 分级是将分子大小相近的物质分开，通 常为生物大分子间的分离。
二、凝胶介质应具备的条件
1、介质本身为惰性物质，在应用过程中它不与溶 质、溶剂分子发生任何作用。 2、应尽量减少介质内含的带点离子基团，以减 少非特异性吸附，提高蛋白质的收率。 3、介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较 窄，在分级分离中这点尤为重要。 4、凝胶球珠大小均匀，即粒径的均一性好，均 一系数越接近1越好。
第二节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤
凝胶过滤（gel filtration ）是利用凝胶的网 状结构根据分子大小进行分离的一种方法。 凝胶像分子筛一样，将大小不同的分子进 行分离，因此凝胶过滤又叫分子筛层析或称 尺寸排阻色谱。
凝胶过滤的优点：
1、介质为不带电的惰性物质，不与溶质分 子作用，因此分离条件温和，蛋白质不 易变性，收率高，重现性好。 2、工作范围广，分离分子量的覆盖面大， 可分离分子量从几百到数百万的分子。 3、设备简单、易于操作，周期短，每次分 离之后不需再生即可连续使用，有的可 连续应用几百次甚至达千次。
2、性能
此类凝胶是经典的凝胶介质，具有较高的选 择性，多种规格的粒径，不同的分离范围及高 的分辨率。但随着介质的不断发展，它已逐渐 被新一代的BioProcess凝胶所取代。 （1）溶胀性 Sephadex系均以干态供应， 使用前必须在过量的溶剂中充分溶胀，沸水浴 可加速溶胀，但要避免剧烈搅拌，以防破碎。 该系在有机溶剂中及在水中的溶胀程度不同。
1、Bio-Gel A系
Bio-Gel A系是美国Bio Rad公司的产 品，为交联琼脂糖凝胶，适用pH值范围413，其主要性能见表9-4.
2、Sepharose
Sepharose系是目前生化分离专用介质 中型号最多，应用最广的最大系列产品。 其合成工艺不断改进，换代产品不断出现， 性能日益完善。
（1）Sepharose 是该系中最早的产品，为非交联结构，因 此不能进行高压灭菌，仅能在2-40度范围内使用。
（2）Sepharose CL 是琼脂糖珠体与2，3-二溴丙醇反应后 具有共价交联键的产物。 （3）Superose 由珠状琼脂糖经过两次交联而制备的新型 凝胶。用含双环氧基及多环氧基的混合长交联剂对琼脂糖 珠体进行第一阶段交联，然后再与含双环氧基的短链交联 剂进行第二次交联，得到的产品为Superose。
（4）Sepharose Fast Flow 此类产品是新型的BioProcess凝 胶介质，是经过高度交联的琼脂糖珠体，大大加强了其机 械强度，以流速快为其特征。
三、聚丙烯酰胺系
Bio-Gel P是丙烯酰胺与N,N’-亚甲基双丙烯 酰胺共聚而成的亲水性凝胶，其中含有极少的游 离电荷，干胶的羧基含量≤3.0mmol/g，因此非 特异吸附性很小，这类合成高聚物结构稳定，不 受微生物侵蚀，可在120度消毒30min后，色谱 性能不变。改变交联剂的用量可控制凝胶孔径的 大小，得到不同排阻极限的系列产品。
二、琼脂糖系
琼脂糖系凝胶都是由经过纯化的琼脂糖制 备的，其中仅含有极少的带电基团。利用琼脂 糖热溶液冷却时可凝胶化的特点，可较方便地 制成珠状物。在凝胶过程中由单独的多糖链先 形成双螺旋，然后聚集成胶束。胶束之间产生 了孔，孔的大小取决于胶束的多少，即琼脂糖 的浓度。采用不同浓度的琼脂糖溶液成球后可 得到不同孔径的珠状凝胶。传统的琼脂糖凝胶， 非特异性吸附极低，分离范围很广，可从 10000-40000000，所以，它适用于分子量差 距较大的分子间分离，分辨率不很高。
5、介质要具有良好的物理化学稳定性及较高的 机械强度，易于消毒，以增加使用寿命。
凝胶过滤介质
在各种分离介质中占有特殊的地位。由于它 有上述优点，能满足生化分离的基本要求，将其 进行化学改性可衍生出种类繁多的层析介质： 可以制备各种离子交换剂及缓冲离子交换剂； 可以制备疏水色谱介质及螯合介质； 可以作为亲和层析吸附剂的载体。 因此可认为凝胶过滤介质是各种层析介质的母 体，所以研制新的凝胶过滤介质、提高改进这类 介质的性能有广泛的重大意义。
除单一的多糖骨架外，还出现了琼脂糖与葡聚糖 接枝而成的复合凝胶Superdex高效过滤介质。新一 代介质的出现提高了生产效率，从小规模过滤发展 成为工业生产应用。
这类以多糖为骨架的介质虽然“古老”，但由于 性能不断改进，产品更新换代，进一步发挥了其 “活力”，故仍然是目前生化分离中应用最广、数 量最多的凝胶过滤介质。