免疫血清制备

免疫血清制备

●实验目的

了解影响机体免疫应答强度的因素;

明确初次应答和再次应答抗体产生的规律；

制备牛血清白蛋白（BSA）的抗血清；

熟悉佐剂的制备和动物免疫的常用方法；

了解抗体检测的常用方法

●实验原理

1.在免疫学实验中,为制备抗体通常以抗原性物质给动物注射,经一定时间后,动物血清中

可产生大量特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免疫血清。它在血清学检测中有广泛应用。理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。

同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。

2.抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物。

物质基础:

1）抗原表位与抗体高变区间的互补结合

2）抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合

3）抗原抗体之间的结合力

4）亲水胶体转化为疏水胶体

3.ELISA原理

ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小

●实验步骤及注意事项

1免疫佐剂制备及动物初次免疫

1.1抗原制备

以1.5mlBSA和1.5ml完全福氏佐剂混合后搅拌10min至完全乳化

1.2动物免疫

用1ml注射器12＃大针头吸出完全乳化的抗原1ml；

换4＃小针头双后足垫和背部皮下接种，每处约10-20μl。(接种处先用碘酒、酒

精消毒)

将免疫后的小鼠放回鼠笼。

1ml注射器（内有乳化好的抗原）贴好标签，4℃保存下次用。

1.3采集阴性血清（每班2只）

用无菌小试管收集未免疫小鼠血（眼眶放血法），标记后送准备室；

室温静置30min,

2,000 rpm离心10分钟;

吸取血清置1.5ml塑料管，做好标记;

2再次免疫及血清采集

2.1血清制备：

取首次免疫后的小鼠2只，采集血清(方法同上),标记后冻存备用。

2.2再次免疫：

其余小鼠于腹腔和背部皮下注射上次制备的乳化抗原，每鼠注射0.5ml。

3血清采集及抗体检测

3.1血清制备：

采集剩余小鼠血,将血置室温半小时凝固;

2,000 rpm离心10分钟;

吸取血清置1ml塑料管，做好标记.

3.2血清抗体检测：

以ELISA测定抗体效价，以未免疫鼠血清作对照。

注意事项：注意无菌操作，并尽可能多的采集血清。

●实验结果及讨论

通过ELISA法测定血清效价是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点。通过使用酶标仪测定OD490光吸收值能够定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性。当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，可是认定为是阳性。本次实验得到的结果显示兔抗鼠免疫血清的效价为400。

●总结

以抗原免疫动物制备的免疫血清，生产的是多克隆抗体。这种抗血清制备的方法有其固有的缺陷，主要是免疫血清中抗体的特异性具有多样性，可与其它抗原发生交叉反应。

而且不同动物或个体产生的抗体质量不能控制，重复性和稳定性差。虽然实际工作中单克隆抗体制剂应用十分广泛，但它不可能全部取代多克隆抗体制剂，在临床检测中，多克隆抗体仍有广泛应用。多克隆抗血清制备方法简单易行，一般实验室均能制备。

【临床意义】免疫血清的应用非常广泛，虽然多有商品供应，但部分诊断血清和科研用免疫血清常需自行制备。因此制备理想的抗血清是实验室工作的基本技术之一，也是医学检验专业学生应具备的基本技能之一。