掌握碱裂解法抽提质粒的原理

实验目的
❖ 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各 主要试剂的作用。
质粒提取的主要步骤：
•细菌的培养 •细菌的收集和裂解 •质粒 DNA 的分离和纯化
提纯的思路
❖ 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA ❖ 要去除的物质：
蛋白 基因组DNA RNA
碱裂解法抽提质粒
1. 手工碱裂解法抽提质粒 2. 质粒提取试剂盒(离心柱型)
▪ 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 ▪ TE缓冲液：溶解DNA
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液（含DNA)
TE溶解DNA
溶液I充分重悬 溶液II裂解
酚抽提(去蛋白）
质粒DNA溶液
乙醇沉淀DNA
溶液III中和
洗涤沉淀
[质粒提取试剂盒组成]
平衡液BL STE缓冲液（溶液P1） Lysis Buffer（溶液P2） 3M NaAc，pH 4.8（溶液P3） 去蛋白液PD 漂洗液PW 洗脱缓冲液EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （10mg/ml）
悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会 大大降低）。
↓
5. 裂解：加250ul溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次, （此时菌液应变得清亮粘稠，
所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）。
(注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质 粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底， 应减少菌体量。)
2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 10000 rpm，1min
倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上
3. 收集菌体： 取1.4ml菌液转入小离心管中
↓ 10000 rpm，1min
弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。
4.悬浮： 加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底
实验仪器与材料
（一）仪器：超净工作台， 恒温摇床，台式离心机， 高压灭菌锅
（二）材料：1.5ml 离心管， 加样枪，含有质粒pQE30 的大肠杆菌TG1 、LB液 体培养基
实验步骤
1. 细菌培养：接种含质粒pQE30的大肠杆菌TG1 10μl 到10ml含氨苄青霉素 (100μg /ml)的LB培养液中， 37℃摇培过夜（10~12h）
质粒的复制型
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:
严谨型(Stringent control) ：只在细胞周期 的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制 一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只 有1～2个质粒
松弛型(Relaxed control) ：质粒在整个细 胞周期中随时可以复制，当染色体复制停 止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中 含有10-200个拷贝。
▪ 溶液III： 5M KAC
作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白－ SDS＋线性DNA沉淀， K＋可中和DNA
☆原理示意图
▪ 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有 机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊 醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫。
质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细
胞一些遗传性状。
载体的选择标准
v 能自主复制； v 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
多个单一酶切位点，称为多克隆位点； v 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛
选和鉴定； v 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
实验原理
❖ 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在 拓扑学上的差异来分离它们。
❖ 在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开； 质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条链不会完全分离。
❖ 当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性 时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态， 离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形 成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大 分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。
8.再次转移上清： 小心地将上清用加样枪转移到吸附柱中（注意尽量不要吸 出沉淀），室温放置1-2分钟
↓10000 rpm, 1 min，弃废液 9. 去蛋白：加入500ul去蛋白液PD于吸附柱中
↓ 10000 rpm, 1 min，弃废液 10. 漂洗DNA：加入700ul漂洗液PW于吸附柱中
↓10000rpm, 1 min ，弃废液 11.再次漂洗DNA: 加入500ul漂洗液PW于吸附柱中
[实验准备]
1. 使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液 P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。
2. 漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂 洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。
3. 使用前先检查平衡液BL、溶液P2 和P3 是否出现浑浊， 如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复 澄清。
❖ 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀 质粒DNA。
手工碱裂解法抽提质粒
试剂：
▪ 溶液I ：50mM 葡萄糖， 25mMTris·HCl
（pH8.0），10mM EDTA 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活
▪ 溶液II： 0.2N NaOH， 1%SDS（新鲜配制）
作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质 变性。
↓百度文库
6.中和： 加350ul溶液P3 ，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出现白色 絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀）。
↓10000 rpm, 10 min
7.转移上清：将上清吸入另一支干净的离心管中（注意尽量不要吸出沉淀）
↓10000 rpm, 10 min
↓10000rpm, 1 min ，弃废液
12. 去漂洗液：将空吸附柱重新置于收集管上，10000rpm，2min，以除去
吸附柱中残余的漂洗液。 ↓
13. 收集质粒：将吸附柱置于一个干净的小离心管上，向吸附膜的中间部位
滴加30ul洗脱漂洗液EB，放置2min，10000 rpm，2min，离心管中即为收