生化分析与实验之PCR专题

（2）引物浓度
0.10.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降
（3）Taq DNA聚合酶
0.50.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降; 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应 产量。 产量。
（4）dNTP
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana 1983年,Mullis发明了PCR技术, 发明了PCR技术 的设想得到实现。 的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq） 等将耐热DNA聚合酶 入了PCR PCR技术 入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余 1989年美国《Science》杂志列PCR 年美国 项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR 1989年为PCR爆 项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆 炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 ,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
二、PCR反应体系和方法
1.PCR反应成份 1.PCR反应成份
（1）模板 单、双链DNA均可。 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑 制剂、DNA结合蛋白类。 制剂、DNA结合蛋白类。 一般100 ngDNA模板/100 一般100 ngDNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
第6轮扩增
Theoretical DNA Amplification
Cycle 1 2 4 10 15 20 25 30 # of DNA copies 2 4 16 1,024 32,768 1,048,576 33,554,432 1,073,741,824
经典PCR循环参数（500bp以内） 循环参数（ 以内） 经典 循环参数 以内
5‘
DNA 聚合酶 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG
3’ 5‘
合成引物
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’ 5’
1971 年 ， Khorana 提出 ： 经过 DNA 1971年 Khorana提出 经过DNA 提出： 变性， 与合适引物杂交， 变性 ， 与合适引物杂交 ， 用 DNA 聚合酶延伸引物， 聚合酶延伸引物 ， 并不断重复该 过程便可克隆tRNA基因。 tRNA基因 过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难 ， 但由于测序和引物合成的困难， 以及70 70年代基因工程技术的发明 以及 70 年代基因工程技术的发明 使克隆基因成为可能，所以， Khorana 的 设 想 被 人 们 遗 忘 了……
（3）延伸 7070-75oC 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度， 主要取决于模版DNA的浓度，一般为 DNA的浓度 25-35次 25-35次 次数过多：扩增效率降低， 次数过多：扩增效率降低，错误掺入率 增加
三、PCR的类型和应用
研究
–基因克隆，DNA测序，分析突变 基因克隆，DNA测序， 基因克隆 测序
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 DNA 方法：采用两种不同浓度的引物。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为 限制性引物和非限制性引物, 限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般 0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量 关键是限制性引物的绝对量。 是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途： 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 基因组DNA结构功能的研究 DNA
Mg++ Mg++
TAAACTAGCGAAACTGCGTAGTGTGTCTAATCCGTGGACGACTTATT ATTTGATCGCTTTGACGCATCACACAGATTAGG CACCTGCTGAATAA
Mg++
A
C
T
G
PCR反应的特点
灵敏度高 1.皮克 皮克(pg=10 量级扩增到微克(ug=10 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 能从100 2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达 病毒检测的灵敏度可达3 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为 细菌检测的最小检出率为3 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、 简便、快速 1.一次性加好反应液 一次性加好反应液， 1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织 等组织的粗提DNA 等组织的粗提DNA
PCR的基本原理
Taq
PCR反应条件 72℃ 55℃ Taq PCR过程 PCR的特点
Taq
Taq
PCR的基本原理
第2轮结束
PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点
模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增
PCR的基本原理
第3轮扩增 PCR反应条件
PCR过程 PCR的特点
第4轮扩增 第5轮扩增
（5） Mg2+
DNA聚合酶的激活剂 聚合酶的激活剂。 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 反应体系 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； 浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降 Taq酶活性丧失 产量下降； 过高影响反应特异性。 Mg2+过高影响反应特异性。
二、PCR的基本原理
标准的PCR反应体系 标准的PCR反应体系 PCR
4种dNTP混合物 各200umol/L dNTP混合物 10～ 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～ 模板DNA 0.1～2ug DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L
95℃
PCR技术专题 PCR技术专题
化学与生命科学学院
目
录
PCR技术简史 PCR技术简史 PCR的原理 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用 PCR的类型和应用
一、PCR技术简史 PCR技术简史
DNA 解旋解链
5’ 3’
合成引物
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
94℃变性
5050-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
72℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
酶 活 性 ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) )
94℃
55℃
72℃
PCR循环 PCR循环
梯度PCR仪 仪 梯度 普通PCR仪 仪 普通
实时荧光定量PCR仪 仪 实时荧光定量
dNTP浓度取决于扩增片段的长度 dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 四种dNTP浓度应相等 dNTP 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 浓度过高易产生错误碱基的掺入， 降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 dNTP可与Mg 结合，使游离的Mg 浓度下降， 可与 DNA聚合酶的活性 聚合酶的活性。 响DNA聚合酶的活性。
A
C
T
G
PRIMER ANNEALING THE STRAND IS RECOGNITION POLYMERASE DUPLICATED EXTENSION MAGNESIUM COFACTOR DENATURATION
TAAACTAGCGAAACT GCGTAGTGTGTCTAATCCGTGGACGACTTATT ATTTGATCGCTTTGACGCATCACACAGATTAGGCACCTGCTGAATAA
Kary B. Mullis（1944－） （ －）
生物样品
DNA片段 PCR PCR技术
基 因 诊 断 基 因 治 疗 基 因 工 程 产 品 法 医 学 检 测 人 类 学 研 究 …… ……
Mullis 的构思
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA 特定DNA片段 DNA片段
诊断
–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 细菌、病毒、寄生虫检测， 细菌
人类基因组工程
–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 遗传图谱的构建，DNA测序， 遗传图谱的构建 测序
法医
–犯罪现场标本分析 犯罪现场标本分析
肿瘤
–各种肿瘤检测 各种肿瘤检测
其他 其他……
1.不对称PCR 1.不对称PCR 不对称
引物设计： 引物设计：
（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无
同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限 制。
3’
5’
3’
5’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
94℃ 94℃ 94℃ 94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72℃ 72℃ 4℃ 5min 30s 45s 1min 7min forever
×30次 30
2
温 度
94
成 条 单 链
形 变 性 2
2
72
22
DNA双螺旋 DNA双螺旋
2
4
Polymerase Chain Reaction (PCR):
Mg++
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3.多重PCR 3.多重PCR (multiplex PCR) 多重
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
巢式PCR PCR（ PCR） 4. 巢式PCR（nested PCR）
是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行 是指利用两套PCR引物（巢式引物） PCR引物 两轮PCR扩增反应。 PCR扩增反应 两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中， 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产 物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩 增。
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3’ 解旋酶解链酶 5’
子链延长
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC GGAUCG 5‘ 引物酶
RNA引物 RNA引物
3’
合成引物
5‘ 引物酶
子链延长
3’
AUCGCG TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
5’
DNA 解旋解链
5’
ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA GGAUCG TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚合酶 3’
2.循环参数 2.循环参数
(1)变性 (1)变性
使双链DNA解链为单链 使双链DNA解链为单链 DNA 95oC 20-30秒 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 温度由引物长度和GC含量决定。 GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结 降低温度可增加反应的灵敏性。 合;降低温度可增加反应的灵敏性。
低浓度引物
高浓度引物
2.反向PCR 2.反向PCR (reverse PCR) 反向
是用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对 是用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对 DNA 某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 DNA片段两侧的未知序列进行扩增 某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 可对未知序列扩增后进行分析, DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA 片段的序列； cDNA的 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的 克隆, 扩增基因文库的插入DNA DNA； 克隆 , 扩增基因文库的插入 DNA ； 建立基因组步移 文库。 文库。
模板DNA
PCR的基本原理
DNA引物
PCR反应条件 55℃ PCR过程 PCR的特点 引物1
引物2
PCR的基本原理
Taq酶 DNA引物
PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点 引物1
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点