一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征

一个几丁质结合蛋白从草地螟鉴定和分子特征

摘要：中肠是昆虫的一个关键屏障，围食膜（PM）在防止外部侵入中起重要作用。PM蛋白质，PM的主要组成部分，确定该膜的结构和功能。从草地螟幼虫的PM的CDNA 文库中筛选出一个新的围食膜蛋白，命名为LstiCBP.LstiCBP的全长cDNA为2606 bp 的长度，并包含一个2403 bp的开放阅读框是前蛋白编码一个808个氨基酸的具有15个氨基酸的信号肽。cDNA的推导蛋白质序列包含8个富含半胱氨酸的几丁质结合结构域（CBD的）。重组LstiCBP用重组质粒DNA成功地表达在BL21细胞和表现出较高的几丁质结合活性。同时在转录和翻译水平检测中肠LstiCBP表达，然而，LstiCBP在草地螟的生化和生理功能需要进一步调查。

1.介绍

围食膜，是无脊椎动物昆虫内脏中的特有结构，它可以保护昆虫免受病毒，细菌，原生动物和蠕虫的入侵，防止食物颗粒磨损肠细胞。在微生物和昆虫的共同进化的过程中，一些微生物形成若干机制破坏PM。与此同时，许多因素的影响，例如，Pseudaletia unipuncta GV（PuGV）增效，几丁质酶，calcoflour和凝集素，可以破坏PM的形成和提高病原体感染昆虫的几率。因此，作为病原微生物天然屏障，围食膜已经成为害虫控制的潜在靶点。

昆虫PM主要由蛋白质和几丁质组成，几丁质结合活性作为其典型特征。识别各种各样昆虫PM蛋白的表征将有助于发展虫害管理目标，以及提供更好的理解PM的功能和发展。目前，对PM的分子结构和形成机制的了解取得了显著的进展，有超过30种PM蛋白或几种昆虫PM蛋白也被鉴定出。四类PM蛋白质是基于该蛋白质在不同溶解度条件下提取而区分的。第1类PM蛋白是那些可以溶于生理盐水，第2类PM的蛋白质可以溶于温和的洗涤剂，第3类PM蛋白包括那些仅由强变性剂提取的和第4类PM蛋白质是不能提取的，即使是强变性剂。第3类蛋白是从PM提取到最多的一类蛋白。这些蛋白质通常具有几丁质结合结构域或peritrophin domains.PM 蛋白质的结构特征主要集中在以下几类：围食膜因子，无脊椎动物肠粘蛋白和蛋白质与几丁质脱乙酰酶结构域。所述的围食膜因子含有60-75个氨基酸残基，并且其特征在于，半胱氨酸残基的conserved register和一个数个芳香族氨基酸残基。所述保守的半胱氨酸残基认为形成的域内二硫键有助于蛋白质在蛋白酶丰富的肠道环境中不被降解。昆虫肠粘蛋白（IIM）是一种高度糖基化的粘蛋白样蛋白非常强烈地结合在1类PMs上，是在Trichoplusiani幼虫[10,29]中确定的，它包含peritrophin-A结构域。几丁质脱乙酰酶（CDA; EC3.5.1.41）是催化在几丁质和脱乙酰几丁质的N-乙酰葡糖胺的乙酰基的水解，从而产生葡糖胺和乙酸水解酶。几丁质脱乙酰酶是新发现的昆虫PM组成成分。

草地螟，草地螟属（鳞翅目：螟蛾科），是一种多食性害虫，它以在35科200种植物和农作物为食，如玉米，大豆，马铃薯，甜菜，向日葵等。它几乎每年都造成了严重的经济损失，并成为最严重的一种害虫在亚洲，欧洲和北美。在这项研究中，我们从草地螟幼虫cDNA文库筛选出了一种新的PM蛋白质，被命名为LstiCBP。新型PM蛋白质表现出强的几丁质结合活性，这使得该蛋白质可能在PM的形成扮演着重要的角色。

2.结果与讨论

2.1 草地螟的CBP基因cDNA克隆

利用cDNA末端（RACE）-PCR扩增技术快速扩增，从草地螟中克隆全长为2606 bp 的CBP cDNA（图1)（GenBankFJ408730)。所述LstiCBP cDNA的开放读框（ORF）包括2403个核苷酸，预测编码含有801个氨基酸的前体蛋白。它的ORF是由一个TAA 终止密码子终止，之后是一个富含AT碱基的非编码区和推定的聚腺苷酸化信号（TATATAA）位于polyA尾的上游的69个碱基处（图1）。推导的蛋白序列显示有15个氨基酸的信号肽，如SignalP预测软件。LstiCBP编码蛋白计算出的分子量和等电点分别为84.7 kDa的和4.14。LstiCBP的亲水性，这是类似的其他昆虫CBPs，计算并绘制序列中的每个残基位置，其中显示，8个残基区域均疏水。该LstiCBP 蛋白进行蛋白分析，以确定它的糖基化是否类似于IIM，并且NetNGlyc1.0分析表明LstiCBP只有三个N-糖基化。使用在线序列分析确定了该蛋白的胰蛋白酶和靡蛋白酶切割位点，其中胰蛋白酶裂解位点和糜蛋白酶切割位点分别在LstiCBP的55

和128个氨基酸处。

图1.该核苷酸序列为L. sticalitis CBP的cDNA序列和其推导的氨基酸序列。说明：信号肽区域（灰色背景），半胱氨酸区域（红底）CBD1-8（下划线），起始密码子和终止密码子（框中）。潜在的多聚腺苷酸化信号序列（双线）。几丁质结合结构域从N-下划线至该蛋白质的C-末端

蛋白质是PM的主要组成部分，以及这些蛋白质结合的几丁质纤维已被认为是在PM的形成是很重要。在这项研究中，我们发现了一种新PM几丁质结合蛋白CBP，这种蛋白质是从草地螟的非归一化的肠cDNA表达文库发现的，这是在与先前的观察一致，该蛋白与大多数PM蛋白质都是几丁质结合蛋白。与IIM不同，IIM是公认为的PM蛋白质中的最重要蛋白，LstiCBP是未糖基化的。在鳞翅目幼虫，胰蛋白酶和糜蛋白酶都是肠的主要消化酶。出人意料的是，LstiCBP潜在胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点较多，但该蛋白质对胰蛋白酶的降解具有很高的耐性。LstiCBP序列的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点的分析表明，大部分切割位点在几丁质结合结构域。这个观察结果与早期报告显示一致，大多数的胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位点是受到保护的，防止肠消化蛋白酶与被掩埋在几丁质结合结构域的切割位点结合，这是非常重要的，因为PM蛋白质在富含蛋白酶环境中是发挥一定作用的。

2.2LstiCBP的特征几丁质结合域

LstiCBP与已知的昆虫CBPs，如TniCBP1，TniCBP2，SexiCBP和SlitCBP的氨基酸序列比对示于图2。经鉴定LstiCBP类似于大多数已经鉴定PM蛋白，并且其特征在于，其包含多个几丁质结合结构域，半胱氨酸残基的保守序列以及由多个芳香族氨基酸残基[2]，8个富含半胱氨酸的区域中每一个具有6个空间以上保守的半胱氨酸残基形成一个推定的CBD（图3）的区域。LstiCBP的CBD有一个保守的序列基序，CX14-15CX5CX9CX12CX7C，它类似于预测几丁质结合的T.ni等PM蛋白质CBPs 的序列和属于peritrophin-A结构域家族[2]。

图2：LstiCBP:与已知的昆虫的氨基酸相似比对。夜蛾CBP1：AAR06265.1;夜蛾CBP2：AAR06266.1;甜菜夜蛾CBP：ABW98673.1;斜纹夜蛾CBP：ADV03161.1。

早期的研究表明，大多数PM蛋白质具有大量几丁质结合结构域，其允许它们的部分降解蛋白片段保留着多个几丁质结合结构域，从而使它们与PM中的几丁质纤维交联形成6个半胱氨酸基序起作用，属于peritrophin-A结构域家族（图3）。像CBP1和蛋白酶丰富的环境。