【免费下载】实验三 酵母核糖核酸的提取及测定实验报告

生物化学实验报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

一、研究背景及目的

RNA（核糖核酸）属酸性高分子化合物，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷

酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，参与蛋白质生物合成、调控基因表达、作为核酶催化生化反应活性等，对维持生物体的正常发育有

着重要作用。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富

含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。核糖核苷酸与其衍生物作为一大类RNA制剂，在生物体内有着诸多的功能，例如：ATP是细胞内的能量通用货币，cAMP作为第二信使传递胞外信号，CoⅠ、CoⅡ、CoA、FAD作为酶的辅因子在

催化反应中起重要作用，UDP等作为单糖载体在糖代谢中起着重要作用等。此外，鸟苷酸（GMP）和肌苷酸（IMP）是强力助鲜剂，胞苷酸（CMP）和尿苷酸（UMP）可作为生产

治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料；在化妆品中加入核酸或其水解物，可促进皮肤蛋

白合成，达到养护皮肤的作用；在农业上，RNA降解物具有促进作物生长增产的作用，因

此RNA制剂被广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等各产业，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。[1]可见，无论是科研工作还是商业产品的生产过程，都需要

大量的纯品RNA作为原料。但是RNA的活化能较高，不易直接合成，而天然材料中的RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，故采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA

就显得至关重要。目前，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其

基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。

本实验中，我们需要了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路，掌握RNA分离纯化

的设计思想及主要的操作细节，并以酵母为材料学习RNA提取和测定的基本操作方法。

二、原理

1.选材

即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料的易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料，本实验中我们以食品用干酵母粉直接作为RNA提取的原料。

2.提取

此处需要明确科研与工业生产的差异。科研工作中，通常需要得到有活性的RNA分子，以研究其生物学功能，故在提取过程中需要保证一级结构不被破坏，而后通过一定的手段

使其恢复到正确的空间结构。所以在提取过程中动作要轻柔，避免机械力（如气泡破裂等）打断RNA链，另外，提取时较多的使用了有机溶剂。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法，其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱

和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。此外实验室所广泛使用的RNA试剂盒使方便、快

速提取纯度高、完整性好的RNA分子实现了可能。

然而在大工业生产中，要求降低成本，只需获得纯品核苷酸，没有必要保证RNA链的完整性，且方法需要适合机械化生产的流水线，因此工业制备RNA常采用浓盐法和稀碱法，用这两种方法所提取的均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。两种方法的原理不同，浓盐法是原理是即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件

下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使RNA释放到盐溶液中；

稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。本实验中，我们使用浓盐法提取RNA。[3]

3.分离与纯化

在提取时我们使用了沸水浴，这不仅使细胞破碎，RNA释放，同时让相当多的一部分

蛋白质变性，疏水氨基酸暴露，溶解性下降，生成沉淀。经过冰浴冷却，温度骤降，热变

性蛋白发生错误折叠形成足够稳定的构象而并非原来的空间结构。这样，离心之后，母体

残渣和热变性蛋白与溶解在上清液中RNA得以分离。随后，根据核酸的两性特点，采用等电沉淀法，调节体系pH 2.0，使RNA以沉淀形式析出。在分离RNA的同时，也除去了一

部分DNA和蛋白质等杂质。最后，利用95%的乙醇洗涤RNA沉淀，由于RNA不溶于乙醇，而其他脂溶性物质溶于乙醇，这样就除去了少量的其他脂溶性杂质。

4.含量测定

测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。三种方法各有特点，但考虑到学生实验的操作时间、

安全性及实验器材等可行性因素，我们在本次实验中用比消光系数法（以紫外法为基础）

测定RNA的OD260值，计算溶液中的RNA含量，最终得出制品纯度和RNA提取率。

三、仪器与试剂

仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、FA1004电子分析

天平（上海精密仪器科技厂）、DL-101-3BS电热鼓风干燥箱（天津市中环科技开发公司）、电磁炉；

器具：微量可调手动移液器（大龙）、具塞刻度试管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研钵；

试剂：10%的NaCl溶液、6M HCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀剂、蒸馏水；

材料：食品用干酵母粉（湖北安琪酵母股份有限公司）。

四、实验步骤

1.粗提取：量取50ml 10%的NaCl溶液，称取7g酵母粉，研磨至面粉状，在研钵中加入10ml 左右的NaCl溶液并研磨成糊状（没有肉眼可见的块状颗粒），将糊状物及剩余NaCl溶液转移至三角瓶，沸水浴浸提至少40min。

2.分离：取出提取液，冰浴冷却10min，转入离心管，3500r/min离心30min，取上

清液。

3.沉淀：将上清液转移至小烧杯中，冰浴冷却至10℃以下。搅拌下（不要过分剧烈）

加入6M HCl调节至pH 2.0，冰浴4h。

4.洗涤：轻柔而彻底地搅拌使沉淀充分悬浮，将悬浊液转入离心管，3500r/min离心

15min，取RNA沉淀。用约15ml 95%的乙醇彻底悬浮搅拌洗涤沉淀，3000r/min离心

10min。洗涤离心3次，弃去上清液。

5.干燥并称重：取预先在80℃烘箱内干燥的硫酸纸精确称重，再将边缘折起成框，备用。将洗涤后的RNA沉淀转移涂布于硫酸纸上，80℃烘箱干燥至沉淀成粉末状。准确称量干燥后的RNA制品及硫酸纸总重并记录。将大部分RNA制品转移至玻璃匀浆器中，称量

剩余沉淀连同硫酸纸的重量并记录。

6.含量测定：向玻璃匀浆器中加入约5ml蒸馏水，充分匀浆至均一的胶体溶液（匀浆

器底部无块状颗粒），转移RNA至洁净的小烧杯中，用10~15ml蒸馏水分次洗涤匀浆器，