生物技术制药重点简答总结

生物技术制药概论

1、生物技术制药过程包括哪些内容（P5）

第一阶段：实验室研究阶段，也称为发现或探索研究，属于应用基础研究阶段;

第二阶段：产品开发阶段，属于应用阶段，与第一阶段统称为研发阶段，即临床前研究;

第三阶段：商业化阶段，是将产品推向市场的过程。

2、详细说明下面专业英语的含义：

Target identification and validation：靶基因的发现和证实

Assay development：建立检验方法

Proof of concept:理论验证

High throughput:高通量筛选

Lead generation:先导化合物的发现

Lead optimization: 先导化合物的优化

System biology：系统生物学

Therapeutics: 治疗学

Commercialization : 商业化

First human dose：人类第一剂量

基因工程制药

3、有哪些方法合成第二链cDNA?

第一：自我引导合成法，（Self priming）：RNaseH 消化mRNA 摸板；cDNA 3’形成发夹结构（loop）；发夹作为引物合成第二链；需要酶：klenow 和S1。第二：大肠杆菌RNaseH酶降解取代法（Replacement synthesis）：RNaseH 在RNA摸板上形成缺口或空隙，从而形成RNA引物；在E.coli DNA polymerase 的驱动下合成非连续性第二链，需要T4 连接酶接合形成完整第二链。

4、有哪些引物用来合成cDNA第一链？

Oligo dT (T=12-18),；随机引物(n=6) ；基因特异性引物(n=18-25)

5、建立cDNA 文库有什么好处？（书）

cDNA文库代表生物某一特定器官或组织在某一特定的发育时期，细胞转录水平上的基因群体。因为基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同的环境条件、不同的分化时期，故基因表达的种类和强度也不尽相同，因此cDNA文库具有组织特异性。一旦获得含有某种组织器官cDNA信息文库，就可用于筛选目的基因、大规模次序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。

6、判定从cDNA文库质量的标准？

（1）cDNA的数量:1-2 million （2）cDNA 的平均长度: 1.5-2.0 kb

（3）全长cDNA的含量: about 50% （4）空载体, 源于ribosomal RNA的cDNA 的数<10%

（5）是否含有目的基因

7、什么是基因表达？

外源基因(exogenous gene)在生物体内的转录(transcription)，翻译(translation) 和加工过程(post translation modification)的过程。

8、选择表达宿主细胞的原则

生长快，成本低，表达产量高，表达产物的生物活性，容易分离和纯化，无毒。

9、大肠杆菌作为表达宿主的优缺点

优点：遗传性状清楚、操作简单、生长快、成本低、种类多、很多表达载体可供使用。成功生产了很多治疗性外源蛋白。

缺点：不能糖基化，产生内毒素，不能正确折叠形成核内包涵体（inclusion bodies)。

10、大肠杆菌遗传标记recA是什么意思？Homologous recombination abolished, desirable for sequences containing direct repeats （同源重组的废除，获得包括直接重复的序列）

11、表达载体应具备的特点, 克隆载体应具备的条件

表达载体应具有的特征：

①能够独立地复制（origin of replication）；

②应具有灵活的克隆位点（multiple cloning

site or polylinker）；

③具有方便的筛选标记（selectable marker），

有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；

④如果在大肠杆菌中表达，则应具有很强的启

动子（promoter），能为大肠杆菌的RNA 聚

合酶所识别；

⑤应具有阻遏子（suppressor），使启动子受到

控制，只有当诱导时才能进行转录；

⑥应具有很强的终止子（terminator）；

⑦所产生的mRNA 必须具有翻译的起始信

号，即起始密码AUG（start codon）和核糖

体结合位点。

克隆载体应具有的特征：

①能够独立地复制（origin of replication）；

②应具有灵活的克隆位点（multiple cloning

site or polylinker）；

③具有方便的筛选标记（selectable marker），

有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选；

12.、pLac, LacI和IPTG的关系

pLac启动子受Lac I负调控，IPTG解除LacI的抑制作用

13、T7 启动子的工作原理。

工作原理：两个表达载体系统，一个表达T7RNA 聚合酶，另一个含有T7启动子。T7聚合

酶为lacUV5 启动子所驱动。lacUV5

为IPTG所诱导。

14、影响大肠杆菌表达的因素。

1、外源基因的拷贝数，即载体的拷贝数，取决

于plasmid origin of replication

2、外源基因的表达效率

a 启动子的强弱,lac trp,tac,T7

b 核糖体结合位点的有效性

c SD序列和起始密码ATG的间距

d密码子codon preference, e.g., UCU,UCC,UCA,UGG 全都编码丝氨酸

3、表达产物的稳定性, 蛋白的半衰期，dimer

(二聚体）较单体稳定，

4、细胞的代谢负荷，控制外源蛋白的表达，

（tight control, without leaking). 改变宿主菌

5、工程菌的培养条件

15、基因体外表达好坏的重要参数

产量（yield)、生物活性(bioactivity)、理化性状、可溶性(solubility)等

16、基因体外移包涵体形式表达的优缺点

包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种由不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。优点：产量高、易纯化、抗蛋白酶、保护宿主

缺点：空间构型错误-无活性

17 、在哺乳动物细胞中表达常用的启动子

病毒源性和细胞源性强启动子，如mCMV、hCMV、hEF-1α、人的c-fos、鸡胞浆β肌动蛋白等启动子18 、有哪些转染哺乳动物细胞的方法？

一：病毒介导的转染方法；

二：非病毒介导的转染方法，包括：脂质体法、磷酸钙共沉淀法、鸡DEAE-葡聚糖法（常用）

钙转染法：原理是沉淀，廉价

DEAE-葡聚糖转染技术(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA

电转染(electroporation) 是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，可以促使细胞吸收外界环境中的DNA分子

压缩DNA转染法：原理是将DNA压缩成微小颗粒；

利用细胞周期转染法：原理是利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的孔隙增大的原理；

提高转染率：（chloroquine) 原理是提高细胞内lysosome 的pH

显微注射法：直接将目的基因通过注射器倒入受体细胞中；DNA分布在细胞周围，让它通过穿刺形成的孔洞或跟随穿刺的针头进入细胞

19、用逆转录病毒介导DNA的过程。

逆转录病毒载体是单链RNA病毒，进入细胞后逆转录为双链DNA并整合在细胞染色体，以此为模板合成病毒基因及子代RNA，再装配成病毒颗粒。载体分为两部分: 增殖性载体和非增殖性载体。20、逆转录病毒载体的主要结构。

一：携带目的基因、标记基因的载体。

二：以反式提供逆转录病毒蛋白的包装细胞系，这种辅助细胞含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。（增殖性载体和非增殖性载体）

21. 什么是装配细胞？装配细胞的主要特点。（1）装配细胞：是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gap、pol、evw所编码的蛋白质，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不同产生任何形式的病毒颗粒。

（2）含顺式功能有缺陷的逆转录病毒，其RNA不能被包装配成病毒颗粒，但能表达所有病毒蛋白，反式补偿进入包装细胞的载体所缺失的基因，将重组逆转录病毒载体导入包装细胞后，可产生有感染力的复制缺陷型病毒，病毒转染细胞使外源基因稳定插入靶细胞染色体。

22、脂质体转染的原理。

脂质体使一种人造的脂质小泡，外周使脂双层，内部使水腔，形成双层质膜包埋DNA如FuGene (Roche) LipoFectaimine (Invitrogen)，把外源DNA 导入培养的哺乳动物细胞。

23、酵母表达载体的类型

根据载体的复制序列，载体可分为四类：

A、YEp类（yeast episomal plasmid （游离质粒）,酵母附加体质粒）含有酵母自然质粒2μ的复制中心REp3 的载体，可独立增殖；拷贝数：低拷贝每个细胞5-50个质粒，高拷贝数：100-200；转化率：103-105/ μg DNA；不稳定：每代质粒丢失率10-2。

B、YRp类（yeast replication plasmid, 酵母复制型质粒）

含有酵母自然增殖中心ARS，由于质粒丢失率非常高10%，所以很少应用。

C、YCp类(yeast centromeric plasmid,酵母着丝