实验二、植物体内硝酸还原酶活力的测定(精)

将新鲜取回的叶片水洗，用吸水纸吸干，然后用 打孔器取小圆片2份，分别置于盛有上述两种溶
液的小烧杯中，混匀后立即放入干燥器中，抽气
1分钟后再通入空气，再抽真空，反复几次，以
排除组织间隙的气体，至叶片完全沉入杯底。将
烧杯取出后，置于30度温箱中，使不见光，保温
30分钟，取出震荡3分钟后加入1ml三氯乙酸使酶
硝酸还原酶的组成

原理：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同 化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐 还原为亚硝酸盐： NO3- +NADH + H+ +H2O
NR
NO2- +NAD+
离体法
实验材料:
新鲜小麦叶片(小麦幼苗提前3天用0.05M KNO3浇灌)
主要步骤

标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入 试剂，配成0-2.0µ g的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀 以亚硝态氮浓度（µ g/mL）为横坐标（X），吸光值
对照组2 反应组
1ml+ 1ml 1ml
1.6ml 1.6ml
0.4ml 0.4ml
— —
反应条件：25°C温箱保温30min
3.反应的终止和活性测定
酶反应结束后，立即加入1 mL磺胺 1 mL萘基乙烯胺 摇匀显色30min 4000r· min-1 x10min 取上清液于540nm处测其吸光值
实验二、植物体内硝酸 还原酶活力的测定
NO3-和NH4+是能被植物利用的最主
要的氮源。在一般田间条件下， NO3- 是植物吸收的主要形式。
硝酸盐的还原
硝酸还原酶
亚硝酸还原酶
硝酸盐
亚硝 酸盐
氨
硝酸还原酶是一种诱导酶，在植物体内本 来不含有，但在特定外来物质的如 NO3诱导下可以生成硝酸还原酶。
植物细胞
NO3—
呼吸代谢
NADH NAD
NO2—
NO3—
NO2—
外界溶液
实验材料
蜀葵的新鲜叶片

配置溶液
对照组： 0.1M pH7.5磷酸缓冲液5ml+蒸 馏水5ml+ 25mM蔗糖溶液0.1ml +异丙醇 0.1ml 反应组：0.1M KNO3溶液10ml+ 25mM蔗 糖溶液0.1ml +异丙醇0.1ml
后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。
为纵坐标（r）建立回归方程。
管号 试剂 ml
亚硝酸钠标准液 蒸馏水 1% 磺胺 0.2%萘基乙烯胺 每管含亚硝态氮 （µ g）
1 0 4 4 0
2
3
4
5
6
7 0 4 4
0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
W——样品重量（g）；

t——反应时间（h）。
注意事项

硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝 酸盐还原为氨。

从显色到比色时间要一致，显色时间过长或 过短对颜色都有影响。

磺胺和萘基乙烯胺溶液加入顺序不能颠倒。

离心管必须俩俩配平。
思考题

测定硝酸还原酶的材料为什么要提前用 硝酸盐浇灌？
活体法
结果计算
X × V /V × V 3 2 1 -1 -1 样品中酶活性（µ g· g · h ）= W×t(h)

X —反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（µ g）； V1——提取酶时加入的缓冲液体积（ml）； V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml）；
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V3——颜色反应时的体积（ml）
2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4
0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
实验步骤：
1. 酶的提取
1g小麦叶片(剪碎放入欲冷的研钵)
加8ml提取液充分研磨，纱布过滤
收集匀浆液于4000rpmx20min,取上清液(粗酶液)
2. 酶反应
反应体系 粗酶液 对照组1 1ml KNO3 1.6ml NADH 磷酸缓 冲液 — 0.4ml
钝化。然后分别吸取1ml，用以测定亚硝态氮含
量（方法与制作标准曲线一致）。