李斯特氏菌检测方法介绍—科标检测

李斯特氏菌检测

李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。

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实验步骤

1. 增菌培养

将未开封的测试片贮藏在≤8℃的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。

取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。

2. 分离

共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。

已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。

加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。

在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和

OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。

3. 鉴定步骤

为防止暴露于潮湿的环境中，请不要冷藏已开封的测试片。将胶带封好的测试片贮藏在低温干燥的地方，保持时间不超过1个月。请勿将测试片放在温度> 25℃和(或)相对湿度>50%的环境中。

1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。

2）从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。

3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。

4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。

4. 用涂抹棒、海棉或其它采样设备收集环境样本。湿润采样设备的液体应≤10 mL。湿润剂可以是无菌水、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和缓冲液，如Lethee n肉汤或Dey/Engley (DE)中和肉汤。

5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。

6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。

7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。

8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养5

天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。本试验还有一等效试验，即加入0.2mL

试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。