微生物技术实验

3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培养基平板上， 用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平 板表面。 4、 诱变 ① 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚 硝基胍结晶，然后将平板倒置于培养箱中 28℃培养24小时。 ② 在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。
5、 涂布平板
① 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到装有4.5ml生 理盐水的试管中，摇匀，制成处理后菌悬液。 ② 取上述菌悬液0.5ml于盛有4.5ml生理盐水的试管 中，稀释到10-4。分别取10-1、10-2、10-3和10-4稀 释液涂布LB平板，每个平板涂0.1ml，经诱变处 理的稀释液每稀释度涂布3个平板，置28℃培养 两天。
CuTY培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g，
CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0
Ⅱ 诱变育种
实验步骤
1、制备菌悬液 ① 挑取少许斜面菌种接种于盛有5ml LB液体 培养基的试管中，28℃振荡培养过夜。 ② 取0.5ml培养液转入另一盛有5ml LB液体 培养基的试管中，28℃振荡培养6-7小时。 2、制作平板 将LB固体培养基融化，倒平板，凝固后待用。
亚硝基胍（NG或NTG）是一种广泛使用的强诱 变剂。它主要在DNA链的复制区引起G:C A:T转换，即使在杀菌率很低的情况下也能 诱发高频率的突变。对于细菌的处理一般 通过制作杀菌曲线，采用杀菌率在70%90%的诱变剂量处理微生物为好。 本实验采用亚硝基胍对分离菌株进行诱变。 主要用点种法和影印法检出缺陷型菌落， 并用生长谱法进行鉴定，获取生物素营养 缺陷型高产黑色素的菌株。
Melanin
SEM Angel et al. J Immunol Methods 2000 Lopez-Serrano et al. Microbiology 2007
黑色素的研究概况
黑色素的类型及其合成途径
真黑色素：多巴途径 棕黑色素 ：酪氨酸氧化为多巴后，有半 胱氨酸参与反应 异黑色素 ：植物和微生物 脓黑色素：尿黑酸途径 神经黑色素 ：脑中产生
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的的结构
a)Octopus dofleini 血蓝 蛋白； b)Limulus polyphemus 血蓝蛋白 c)Lpomoea batatas儿茶 酚氧化酶； d)castaneoglobisporus( 链霉菌)酪氨酸酶； e) 四个活性位点的重叠说 明四种蛋白活性中心具 有高度的结构相似性。
② 影印法 • 取无菌MM、LB培养基各一皿，在平皿底部 画箭头作为方向标记。选择一个菌落分散 的培养皿作为母平皿，作如上标记，并在 影印板上也作同样标记。 • 将母平皿对好标记倒放在影印板的绒布上， 然后轻轻放下，立即把MM培养皿对好标记 倒放在影印板下，取下MM培养皿，再印 Cu-TY培养板。 28℃培养两天左右。
微生物技术实验
产黑色素菌株的分离、选育和发酵
黑色素 (melanin)
研究背景
广泛分布在动物、植物、真菌及细菌中的一类重要色素
真黑色素(eumelanins) 棕黑色素( phaeomelanins ) 异黑色素(allomelanins) 神经黑色素(neuromelanins) 脓黑色素(pyomelanins)
• 3.有机合成及化学修饰 • 4.应用于生物传感器 ：检测酚类等
实验步骤
Ⅰ 分离产黑色素的细菌 Ⅱ 诱变育种 Ⅲ 发酵生产黑色素
Ⅰ 分离产黑色素的细菌
在自然界中，土壤是微生物生活的大本营， 是人类开发利用微生物资源的重要基地。 分离微生物的策略 分离微生物常用的方法： 稀释平板分离法和划线分离法
发酵培养基
⑴ FW发酵培养基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g， NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； ⑵ CuFW发酵培养基： 在1000ml FW发酵培养基中加入CuCl2 0.1mM ；
⑶ TY发酵培养基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化钙 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000ml，pH7.0 ⑷ CuTY培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0
黑色素的研究概况
黑色素生物功能
• 外表修饰功能
• 人体中，黑色素的种类和含量不同，造成头发、皮肤、眼睛颜色的差异。 防御功能
乌贼和章鱼释放的墨汁作为烟幕弹躲避捕食者。 • 真菌细胞在感染过程中合成黑色素抵抗人体的免疫机制 抗辐射作用 。 黑色素有助于机体抵抗紫外线及其它各种辐射，
• 神经系统多种疾病与黑色素产生缺陷相关
⑶ 产黑色素的性质 观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。
Ⅱ 诱变育种
获得营养缺陷型（生物素）高产黑色素的菌株
实验原理 基因突变是微生物诱变育种的理论依据。 生物经理化因子的处理可以提高基因突变的频率， 因此采用物理因素或化学因素处理微生物，使其 体内的DNA发生改变，以提高突变频率和扩大遗传 变异的幅度，然后从中筛选出所需要的突变菌株， 这便是诱变育种。 其中在营养上表现出某种缺陷的变异菌株，叫做缺 陷型菌株。它是遗传学研究和遗传育种工作中不 可缺少的重要材料。
表1 初测结果（用“+”表示生长）
菌落编号 添加物
ห้องสมุดไป่ตู้
1
2
3
4
5
6
7
……
氨基酸 维生素 碱 基
表2 准确鉴定结果
菌落编号 菌落生长区 缺陷的营养物质 1 2 3 4 5
Ⅲ 发酵生产黑色素
现代意义的发酵主要是利用微生物对周围环境极大 的适应能力、极强的消化能力和繁殖能力等特点， 通过发酵罐大量繁殖微生物来制备所需产品。 发酵工业的生产流程一般是：保藏斜面→活化斜面 →摇瓶种子→种子罐→发酵罐，小型实验可以略 去种子罐一步。 本实验中主要使用摇瓶进行发酵条件的实验。发酵 生产过程中要随时观察菌体生长情况。本实验与 生产中菌浓度的测定方法一样，采用分光光度计 法。
Ⅰ实验步骤：
1、 土样采集点的确定： 要求采集地具有代表性，能代表该地主要 土壤类型和主要植被类型。
2、 土壤取样方法：将表层土铲去5-10cm， 用干净的采样铲取约50g土，每个采样点至 少取10处，并将所采土样装于无菌塑料袋 中混合，然后把样品置通风阴凉处碾碎。
3、 菌的分离：称10g土样于水中，放入盛有 90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振 荡约20分钟，使土样与水充分混合，并使 细胞分散。用一支1 ml无菌吸管吸取1ml土 壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分 混匀，此为10-1稀释液，以此类推做10倍稀 释，取10-3、10-4、10-5、10-6稀释液0.1ml 涂布平板。28℃培养3天。
上述三种方法中，在MM培养基上不长而在 LB培养基上生长的菌落可能是缺陷型菌株， 需要进一步复证。
7、将可能为缺陷型的菌落编号，分别接入 5ml LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
8、营养缺陷型的鉴定 ① 初步鉴定 取0.1 ml培养液涂布在MM培养基上。待干后： 皿底按图分成三个区域，并分别标上A(混 合氨基酸)，V(混合维生素)和B(碱基混合 物 )。 在每一区域中央分别对应地加入混合氨基酸、 混合维生素和碱基混合物。置28℃培养两 天后，区别该菌属于哪一类缺陷型。
③ 夹层法 • 取无菌培养皿3皿，各倒一薄层( 约5 ml )MM培养 基，凝固后加入0.1 ml经诱变处理的10-5倍稀释 液，再加入约5 ml的MM培养基，摇匀，凝固后再 盖上一层约5 ml的MM培养基。待凝固后置28℃ 培养两天左右。 • 取出上述培养平板，在皿底把已长出的菌落作好 标记，统计其菌落数，再盖上一层约5 ml的半固 体LB培养基。置28℃培养两天。
•如着色性干皮病，帕金森氏病，老年性痴呆症，亨廷氏舞蹈病等。 清除自由基和活性氧物质
具有黑色孢子的真菌比无色孢子的真菌更能抵抗紫外线和太阳光的辐射。
动物皮肤中的黑色素的产生是对紫外线辐射伤害的一种反应，它是目前 能不断吸收环境中的自由基，从而对生物体提供保护。 • 所知道的唯一的保护皮肤免受辐射伤害的天然生物聚合物。 阻止病毒的感染
Vegetable & fruit browning
Diseases:
Albinism
Melanoma Correlate with Parkinson disease Deaf
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的应用
• 1.合成左旋多巴和黑色素 :帕金森病 等； • 2.食品工业方面——褐变：色泽
② 准确鉴定 按上述方法，将初步测定为某一类缺陷型的 菌株制成菌悬液，涂布在MM培养基上。在 皿底划分区域，划分的区域数和需添加的 生长因素编组数相同。 按区域对应地加入编组混合物。碱基的种类 较少，可单一地加入，不必分组。28℃培 养两天后观察结果。
9、 产黑快慢的比较 将鉴定的营养缺陷型菌株与出发菌株分别 在CuTY平板上划线，比较各个菌株产生 黑色素的快慢，置28℃培养两天。之后 选取高产黑色素的菌株进行发酵。
Ⅱ 诱变育种
培养基
LB培养基（完全培养基）：蛋白胨 10g，酵母提取物
5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2
基本培养基MM：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，
柠檬酸钠 0.5g，MgSO4· 7H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000ml，pH自然（~7.0）
二级结构模型图 基本单体及氧化还原产物
结构复杂、非均质、异源多聚的芳香族化合物
黑色素的研究概况
黑色素的分布及基本特征
• 黑色素广泛存在于生物界中的一类从红色， 褐色到黑色的天然色素 Natural red to black pigments Non-toxicity to environment and animals • 黑色素含有自由基，这在天然物质中很少 见，而且它能象海绵一样吸收环境中的自 由基
Ⅲ 发酵生产黑色素—实验步骤
1、菌种活化 取保藏斜面菌种划线接种于CuTY平板，28℃ 培养24小时。
2、种子培养 接一单菌落至装有5mL液体LB培养基的试管 中，28℃振荡培养24小时。
3、 发酵培养 将上述培养液1ml分别接种到四种装有50ml发酵培 养基的250ml摇瓶中，8层纱布封口，28℃、 200rpm的恒温摇床上培养。 4、取样 每隔24小时取4ml的发酵液，离心后取上清液用 721型分光光度计测 OD400值。OD400值表示各实 验菌株产黑色素状况，结果填入表3。菌体沉淀用 4ml的蒸馏水悬浮后测 OD600（菌浓度）。直至培 养96小时结束。
黑色素具有选择性抗病毒活力，能阻止HIV病毒、流感病毒对动物细胞的感染
细菌黑色素合成关键酶 ——酪氨酸酶Tyrosinase (EC 1.14.18.1)
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的生化性质及生理功能
• 酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），广泛存在于 动物、植物及微生物中 • 特殊之处：同时具有两种不同的催化活性： 以单酚物质如酪氨酸为底物的单酚氧化酶 的活性，又称甲酚酶活性；以双酚物质如 左旋多巴为底物的双酚氧化酶的活性，又 称为儿茶酚氧化酶活性
4、 纯化：挑取产黑色素(包括红至褐色素)的 单个菌落接种斜面，同时作涂片检查，若 有不纯，应进一步挑取此菌落采用划线分 离或制成菌悬液作稀释分离，直至获得纯 培养。 5、 复筛：将纯化的菌种在筛选平板上划线， 28℃培养2天。
6、 菌株性质鉴定 ⑴ 菌落特征 观察在筛选平板上产黑色素菌落的特征。 ⑵ 革兰氏染色显微镜观察 ⑶ 产黑色素的性质 观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。
(凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用1N NaOH溶液 浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要 让含有NG的上清液滴在皮肤或衣物上)
6、营养缺陷型的检出 ① 点种法 取基本培养基(MM)和完全培养基(LB)平板， 作好成对与方向的标记(即一皿MM和一皿 LB为一对)，将事先已编号的格子纸分别放 在两培养皿的底部。用无菌牙签小心地在 待测菌落表面挑取少许细胞，分别点在MM 和LB培养皿的对应位置上(先点MM，后点 LB)。尽可能多点些菌落。置28℃培养两天。