生化实验六 酶的基本性质

课程名称： 生物化学实验 指导老师： 史影 成绩： 实验名称： 酶的基本性质实验——底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度 同组学生姓名： 陈莞尔，潘盛警
Ⅰ.酶的基本性质——底物专一性 一、实验目的
1.了解酶的专一性。

2.掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。

3.学会排除干扰因素，设计酶学实验。

二、基本原理
酶是具有高度专一性的有催化功能的蛋白质。

酶蛋白结构决定了酶的功能——酶的高效性，酶促反应要比无机催化反应快数十倍。

酶催化的一个重要特点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对一种或一类底物其催化作用，对其他底物无催化反应。

根据各种酶对底物的选择程度不同，可分成下列几种：
1.相对专一性。

一种酶能催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。

2.绝对专一性：有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物，而不作用于任何其他物质。

如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。

如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作用其它双糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纤维素。

3.立体异构专一性：有些酶只有作用于底物的立体异构物中的一种，而对另一种则全无作用。

如酵母中的糖酶类只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。

本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖水解反应的催化作用来观察酶的专一性。

用Benedict 试剂检测反应产物。

Benedict 试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成砖红色氧化铜沉淀。

Na 2CO 3+ 2H 2O 2NaOH + H 2CO 3 CuSO 4+ 2NaOH Cu(OH)2+ Na 2SO 4
专业：____生物工程 姓名：_____陈传鑫 学号：___3090104963 日期：____2011.3.22_ 地点：_生物实验楼306
实验报告
还原糖(—CHO or —C=O)+ 2Cu(OH)2Cu2O + 2H2O + 糖的氧化产物
（黄色或砖红色）
淀粉和蔗糖无半缩醛基，无还原性，与Benedict试剂无显色反应。

淀粉被淀粉酶水解后产生葡萄糖，蔗糖被蔗糖酶水解后产生果糖和葡萄糖，产物都是还原糖，因此能被Benedict 试剂氧化生成砖红色的Cu2O沉淀。

三、实验材料与试剂
1、实验材料
⑴蔗糖酶(样品Ⅳ）；⑵新鲜唾液（含唾液淀粉酶）；
2、实验试剂
⑴蔗糖酶液
蔗糖酶液(样品Ⅳ）加蒸馏水适当稀释，备用；
⑵唾液淀粉酶液（学生自制）
取0.5mL唾液至25ml量筒中，用蒸馏水（稀释）到25ml，用棉花过滤备用。

唾液稀倍数因人而异，可稀释50～400倍，甚至更高；
⑶5%蔗糖（A.R.）溶液；
⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；
⑸Benedict试剂；
四、实验器材与仪器
1.漏斗，
2.脱脂棉花；
3.恒温水浴（37℃，100℃）；
4.量筒；
5.试管；
6.烧杯；
7.吸量管。

五、实验内容
酶的专一性实验，按下表操作。

检查试剂淀粉酶的专一性蔗糖酶的专一性编号①②③④⑤⑥⑦⑧⑨
0.5%淀粉
3 3 3
（0.3%NaCl）
溶液(ml)
5%蔗糖溶液
3 3 3
(ml)
蒸馏水
3 3 3
(ml)
唾液淀粉酶液
1 1 1
(ml)
蔗糖酶溶液
1 1 1
(ml)
摇匀，置37℃水浴保温10min
Benedict试剂
2 2 2 2 2 2 2 2 2
(ml)
摇匀，置沸水浴煮2～3min
记录观察结果蓝色蓝色蓝色砖红色蓝色蓝色蓝色黄绿色蓝色
六、结果分析和讨论
结果：⑴①、②、③号试管均呈硫酸铜的蓝色，说明这3支试管内无还原糖，淀粉和蔗糖均未水解；
⑵④号试管呈砖红色说明试管内淀粉被水解，⑤号试管呈蓝色说明试管内蔗糖未水解，⑥号试管呈蓝色说明无还原糖，从这三支试管看出唾液淀粉酶只对淀粉有催化活性，不能催化蔗糖水解，具有对淀粉的底物专一性；
⑶⑧号试管呈黄绿色，说明试管中部分蔗糖被水解，但未水解完全，⑦号试管呈蓝色说明淀粉未水解，⑨号试管呈蓝色说明无还原糖，从这三支试管看出蔗糖酶只对蔗糖的水解有催化作用，对淀粉无催化作用，具有对蔗糖的底物专一性。

七、思考题
1．观察酶专一性实验为什么要设计这3组实验？每组各有何意义？蒸馏水有何用？
答：第一组作为整个实验的空白对照组，检测Benedict试剂对实验结果的颜色有何影响。

第二组作为检测淀粉酶的专一性实验组，第三组作为检测蔗糖酶的专一性的实验组。

蒸馏水作为每一个组中的空白对照，与组内其余两组进行对照。

2．将酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，观察有何结果？
答：二、三组的实验结果将和一组相同，即每组中3支试管都呈蓝色，因为酶在煮沸过程中已经变性，失去催化活性，故不能催化各自对应底物的水解反应。

3．在此实验中，为什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？
答：0.3%NaCl中的Cl-是作为激活剂激活唾液淀粉酶的活性，使实验结果不至于因为唾液淀粉酶的活性不足而导致不同。

Ⅱ. 影响酶活性的因素——激活剂和抑制剂
一、实验目的和要求
1. 了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。

2. 学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反应速度的原理和方法。

二、实验基本原理
在酶促反应过程中，酶的活性常收到某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为激活剂；某些物质它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，称为酶的抑制剂。

酶的激活剂种类：
1、一些简单的无机离子，如Mg2+、Cl-等；
2、一些中等大小的有机分子，如抗坏血酸等也是激活剂，它们对某些含巯基的酶具有激活作用；
3、有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，因而能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如EDTA 能除去重金属，因而能解除重金属对酶的抑制作用。

4、具有蛋白质性质的大分子物质，这些激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的酶。

酶的抑制剂有许多种：如重金属离子（Ag+、Hg2+、Pb2＋、Cu2＋等）、CO 、氯化物、H2S 、砷化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂。

少量的激活剂或抑制剂就能影响酶的活性，而且常具有特异性。

值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，各种激活剂对酶的作用是不同的。

本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。

淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与碘作用的颜色反应如下：
淀粉 紫色糊精 红色糊精
无色糊精 麦芽糖 葡萄糖 显蓝色 显紫色 显红色 不显色 不显色 不显色 （ 碘色） （碘色） （碘色）
I 2
仍为多糖 （无还原性） （有还原性）
本实验中，Cl- 为唾液淀粉酶的激活剂；Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。

利用淀粉酶别水解不同阶段产物与碘有不同的呈色反应，观察唾液淀粉酶的酶促反应中的激活和抑制现象。

水解程度通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色变化判断。

三、实验材料与试剂
1、实验材料
新鲜唾液
2、实验试剂
⑴唾液淀粉酶（学生自制）
取唾液1ml至25ml量筒中，用蒸馏水稀释至25ml，用棉花过滤备用。

唾液稀释倍数因人而异，可稀释50～400倍，甚至更高。

⑵0.1% 淀粉溶液
⑶1.0% 氯化钠溶液
⑷1.0% 硫酸铜溶液
⑸1.0% 硫酸钠溶液
⑹碘化钾-碘液
四、实验器材和仪器
1.试管及试管架
2.量筒
3.漏斗
4.脱脂棉花
5.点滴板
6.吸量管
7.恒温水浴（37℃）
五、实验步骤
试管编号
123 4
试剂处理
0.1%淀粉溶液(ml) 3333
1% 硫酸铜溶液(ml) 1
1% 氯化钠溶液(ml) 1
1% 硫酸钠溶液(ml) 1
蒸馏水(ml) 1
唾液淀粉酶(ml) 1 1 1 1
混匀，37℃恒温水浴，保温10min
碘化钾-碘液（滴） 1 1 1 1
记录观察结果深蓝偏黑红棕色深蓝色深蓝色
注意：⑴找出准确的保温时间，是本实验是实验能否成功的关键步骤之一，唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定，通过37℃水浴溶保温计时，反应时间最好在8～15min以内，只有确定准确的保温时间才能进行实验。

（2）加入酶液后，务必充分摇匀，保证酶与全部淀粉液接触的反应才能得到理想的颜色梯度变化结果。

（3）碘化钾–碘液不要过早地加到点滴板上，以免碘液挥发，影响显色效果。

六、结果讨论与分析
结果：①反应时间在17min中时能明显区分各管颜色不同。

②试管1中颜色最深，说明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；试管2中颜色最浅，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，说明NaCl可以激活淀粉酶的活性；试管3、4中颜色基本一致，且深浅居于试管1、2之间，淀粉酶活性一般，说明Na+、SO42-对淀粉酶活性都没有影响。

故总体上看，可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。

③同时，因为各管的结果颜色都偏深，所以使用的唾液淀粉酶样品活性不高，这与区分各管颜色差别需要反应时间较长（17min）相符合。

七、思考题
1. 激活剂可分哪几类？本实验中NaCl、硫酸铜是属于哪种类型？
答：激活剂可分为：简单无机离子、中等大小有机分子、能出去抑制剂的物质、具有蛋白质性质的大分子物质等。

NaCl属于简单无机离子；CuSO4属于重金属抑制剂。

2. 本实验中，1，2，3，4管各有何用意？为什么要设计第3管和第4管？
答：1管可观察抑制剂对反应影响的现象，2管可观察激活剂对反应影响的现象，第3管可以将1管中的Na+和2管中的SO42-对反应的影响去除，4管作为空白对照。

3. 抑制剂与变性剂有何不同？试举例说明。

答：抑制剂只改变酶的催化活性，并不使蛋白质变性，其影响是可逆的；变性剂破坏了蛋白质的高级结构，使蛋白质变性，并且多数变性剂的影响是不可逆的。

如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂，但如果将Cu2+去除淀粉酶的活性又可以变为正常水平。

Ⅲ. 影响酶活性的因素——温度，最适温度测定
一、实验目的和要求
1. 了解温度对酶活力的影响；
2. 学习测定最适温度的原理和方法；
二、实验基本原理
酶的催化反应受温度影响很大，每一种酶所催化的反应，在一定条件下，仅在某一温度范围内表现出最大的活力，即反应速度最大时的温度，这个温度称为该酶促反应的最适温度，高于或低于最适温度时，反应速度逐渐下降。

因此，酶促反应与温度的关系，用酶活力对温度作图，通常具有钟罩形曲线特征。

温度与酶活力的关系测定是选择一定的条件，把底物浓度、酶浓度、反应时间、pH等固定在最适状态下，然后在一系列不同温度条件下，进行反应初速度测定，以酶反应初速度对温度作图，可以得一个钟罩形的曲线，即为温度—酶活性曲线，在某温度有一酶活力最大值，这个温度即为最适温度。

实验①利用唾液淀粉酶为试验对象，在0℃～65℃之间选择不同的温度，进行酶活力测定。

根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温度。

实验②采用蔗糖酶为试验对象，在室温至75℃之间选择不同温度进行酶活力测定。

蔗糖酶的活力常以其反应产物还原糖（葡萄糖）的生成量来表示。

测定还原糖的方法很多，本实验选择3,5–二硝基水扬酸法测定还原糖量。

在碱性条件下，3,5–二硝水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成红色氨基化合物，并在一定浓度范围内，还原糖的量与反应溶液所呈棕红色物质颜色的深浅程度成正比。

因此，可以用分光光度法测定酶促反应后生成的还原糖量，从而测定蔗糖水解的速度和酶活力。

三、实验材料与试剂
1、实验材料
⑴蔗糖酶液(样品Ⅳ）加蒸馏水适当稀释，备用；⑵新鲜唾液。

2、实验试剂
⑴0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6）⑵5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）
⑶3,5—二硝基水扬酸（简称DNS）试剂⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）
⑸IK-I2溶液
四、实验器材与仪器
1.试管及试管架， 2．恒温水浴， 3．吸量管, 4．滴管, 5．点滴板，6．分光光度计， 7．制冰机。

五、实验步骤
⑴温度对唾液淀粉酶活力的影响
按下表操作
管 号 试 剂
1 2 3 4 5 0.5%淀粉液（0.3%NaCl ）(ml) 2 2 2 2 2 温度 （℃） 冰浴约0℃
室温
37 50
65
各保温5min
唾液淀粉酶 （ml ）
1
1
1
1
1
将试管内溶液混匀后，置各相应温度，保温10min
IK-I2液 （滴）
1 1 1 1 1 记录颜色变化
蓝色
蓝色
红棕色
橙红色
蓝色
温度-酶活力曲线图 ⑵温度对蔗糖酶活力的影响
编号 条件
0 1 2 3 4 5 反应温度（℃）
室 温 室 温 37 50 65 75 0.2mol/L 醋酸缓冲液（pH4.6）(ml)
1
1
1
1
1
1
颜
色
深浅
温度（℃） 0 70
37 深 浅 50
5%蔗糖溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
预热3min
稀释酶液(样品Ⅳ）(ml) (作相应的预温）
H2O
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 保温反应10 min
3,5–二硝基水杨酸（ml） 1 1 1 1 1 1
混匀后，100℃加热5min
蒸馏水（ml） 5 5 5 5 5 5
A5200 0.341 1.165 1.320 0.668 0.075
六、结果分析讨论
⑴温度对唾液淀粉酶活力的影响
从温度对唾液淀粉酶的活力曲线可以看出，当温度为50℃时颜色最浅，即淀粉水解最完全，唾液淀粉酶的活性最高；在50℃两边唾液淀粉酶的活性都随着温度的改变而降低，故本组实验的唾液淀粉酶的最适温度在50℃左右。

唾液淀粉酶的活性并不是在正常的人体体温37℃时最适，根据激活剂和抑制剂探索中的结果颜色普遍偏深，主要原因认为是本组的唾液淀粉酶样品活性不高，故样品的最适温度较正常情况有所提高，不是37℃而是本次实验测得的50℃。

⑵温度对蔗糖酶活力的影响
由试剂在520nm波长的吸光度对温度作图得到如上图的A520-T曲线。

由图线看出蔗糖酶在50℃时活性最高，故蔗糖酶的最适温度为50℃。

同时由曲线看出温度高于70℃后酶活性显著下降，这是因为此时酶已经因为高温发生了变性，失去了大部分的催化活性，故催化能力大大减弱。

七、思考题
1．什么是酶的最适温度？有何用途？
答：酶的最适温度是酶促反应在速率最大时的温度。

在最适温度下，酶的催化活性最高，此时酶促反应的效率最高，可由此最快的获得产物。

2．酶反应的最适温度是酶特性的物理常数吗？它与哪些因素有关？
答：不是特征常数。

它和pH、抑制剂和激活剂存在与否、底物浓度等因素都有关。

3．通过以上几个酶学实验，总结酶有哪些特性？影响酶活性的因素有哪些？在实际应用中应注意哪些问题？
答：酶有底物专一性、高效性、有最适温度等特性。

影响酶活性的因素有pH、温度、底物浓度、激活剂和抑制剂。

在实际应用中应该注意多种不同的因素对酶活性的总体影响，而不能只看一种或某几种因素的单独影响。