包涵体变性、复性及纯化
基因工程复习提纲-包涵体补充
（4）包涵体的变性-复性操作包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是在人工条件下，拆开包涵体内蛋白质中错配的二硫键和次级键，使包涵体溶解并重新进入复性途径。
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂：SDS、正十二醇肌氨酸。
廉价，但影响复性和纯化促溶剂：盐酸胍、尿素。
前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应。
混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲亚砜等联合使用，溶解力强。
极端pH：廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应。
包涵体的复性与重折叠（refolding）：包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠；通过次级键的形成使蛋白质复性。
包涵体复性操作的方法包括：一步稀释法：蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大。
分段稀释法：逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生。
试剂添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca 2+。
蛋白修饰法：氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚。
产物隔离法：将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞。
分子伴侣法：GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达。
包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。
在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。
形成二硫键的方式主要有：化学氧化法（A）：需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠。
二硫键交换（B）：需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
包涵体蛋白质复性即纯化策略
(a) 0.5% SDS, (b) 8M urea, (c) 6M GuHCl at pH 9.0, RT except one buffer with (d) GuHCl at 4C. Dissolution efficiency was determined as the mass of the monomeric proteins detected by RP-HPLC divided by that of the total expressed proteins
Loading
(7M urea-solubilized IB)
Chasing
Urea washing
(Refolding)
Elution (1M NaCl)
Regeneration
Chromatogram from column refolding
Example page: Effect of Solution pH
Effect of pH on rhGH-GST Inclusion Body Dissolution
6 5 4 3 2 1 0
(e) (f) (g) (h)
Washed IB was placed in NaHCO3 buffer containing 0.5% SDS at pH (e) 5.0 (f) 7.0 (g) 9.5 (h) 12
- However, cleaving the fusion partner away from the refolded
protein can be costly and problematic.
• PEG (polyethyleneglycol)
- Some non-ionic surfactants such as PEG and Tween are
蛋白质、包涵体复性
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
包涵体的纯化和复性情况总结
板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。
常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。
我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。
二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。
我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。
我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠。
不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。
最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。
回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。
并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。
但根据我个人的经验。
如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。
否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。
另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。
有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体复性与纯化
RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等， 环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等 3. 大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml） 4. 非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等
一、包涵体的定义及其特点
包涵体形成的原因
▪ 表达产率过高：超过了细菌正常的代谢水平，没有足够的时间进行折 叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质 无法达到足够的溶解度等。
三、包涵体的制备
裂菌
▪ 超声波处理法 ▪ 化学处理法 ▪ 反复冻融法 ▪ 高速组织捣碎
三、包涵体的制备
包涵体的制备
▪ 对于包涵体的纯化，包涵 体ห้องสมุดไป่ตู้前处理很重要。
▪ 由于脂质体及部分破碎的 细胞膜及膜蛋白与包涵体 粘连在一起，在溶解包涵 体之前要先洗涤包涵体.
三、包涵体的制备
▪ 中性去垢剂：Tween、Triton、Lubel、 NP40、脱氧胆酸盐等。
氨酸，使用浓度：50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使 用5mM浓度。 ▪ 还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，对于目标蛋 白没有二硫键的某些包涵体也能增溶，可能由于含二硫键 的杂蛋白影响了包涵体的溶解。 ▪ 碱性环境有利于二硫键的还原 ▪ 还原剂的存在会影响蛋白复性，故复性前应去除还原剂。
基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化
基因重组蛋白L243诱导表达包涵体的变性、复性与纯化麻晓庆;王继红;韩晓曦;褚丹;张丕桥;李庆伟【摘要】目的对来自于日本七鳃鳗的基因重组蛋白L243包涵体进行变性、复性与纯化,以获得成分均一的活性蛋白.方法以6 mol/L尿素为变性剂,以0.1 mol/L 氧化型谷胱甘肽及0.9 mol/L还原型谷胱甘肽为复性剂,对构建于pET23b的日本七鳃鳗L243基因在大肠杆菌Rosetta中表达的包涵体进行了的变性、复性与组氨酸亲和层析纯化.结果经变性、复性后,获得了均质的L243纯化蛋白,该蛋白的复性率达80%.结论成功对上述重组蛋白包涵体进行了变性、复性及纯化,为后续与此蛋白相关的生物活性测定奠定了物质基础.【期刊名称】《吉林医药学院学报》【年(卷),期】2007(028)001【总页数】3页(P1-3)【关键词】重组蛋白;包涵体;亲和层析;变性、复性【作者】麻晓庆;王继红;韩晓曦;褚丹;张丕桥;李庆伟【作者单位】辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学院,辽宁,大连,116029【正文语种】中文【中图分类】Q784包涵体是指细菌表达的基因重组蛋白在细胞内凝集而形成的无活性的固体聚集体。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶E.Coli、外膜蛋白OMPC、ompF和ompA、环状或缺口的质粒DNA，以及脂体与脂多糖等。
包涵体的大小约为0.5～1 μm，难溶于水，只溶于变性剂如尿素(脲)、盐酸胍等。
由于包涵体中富含基因重组蛋白且易于分离纯化，所以只要能够在体外成功复性，其将是大量生产重组蛋白最有效的途径之一[1-5]。
L243蛋白为pET23b-L243重组质粒转化至原核表达菌Rosetta后的表达产物，分子量为20 kDa，在大肠杆菌Rosetta中表达后以包涵体形式大量存在。
His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化
His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化若目的蛋白在上清表达，则使用试剂盒buffer （NovagenHiBindPurificationKit,70239）；若为包涵体，则需自配buffer。
（1）试剂准备①12.5mL1某chargebuffer（1.6mL原液+10.9mLSW）②32.5mL1某bindingbuffer（4mL原液+28.5mLSW）③15mL1某wahbuffer（1.9mL原液+13.1mLSW）④15mL1某Elutebuffer(3.8mL原液+11.2mLSW)（2）装柱①盖上下盖，轻轻混匀Hi-bindRein（若柱子不是首次使用，只需把已再生的柱床小心重悬，同样过夜沉降即可）。
②转移4mLHi-bindRein至柱中，沿管壁流下，一次性加足，否则胶面会形成断面，影响吸附效果。
③用封口膜封住上口，置4℃冰箱，沉降过夜。
（3）过柱前准备（大约1h）①使胶床上液依重力自动流下。
②待留至床顶时，依次加入以下溶液（用滴管沿管壁小心加入，且要一次性加足）a.7.5mL无菌SWb.12.5mL1某chargebufferc.7.5mL1某bindingbuffer注：各步骤间连接要流畅，勿使胶床干燥（4）上样过程上样时同前一样，要小心贴壁加入，可一次性加满柱子（会使样品流有较大压力），随时可补加样品，使柱子保持满的状态。
（5）洗脱依次加入：①25mL1某bindingbuffer②15mL1某wahbuffer③15mL1某Elutebuffer收集前8管（首先塞上下面的塞子，室温放置20min，再收集）跑胶，进行蛋白浓度测定。
（6）柱再生①1某tripbuffer配制7.5mL1某tripbuffer：1.9mL原液+5.6mLSW②柱子纯化完后，加入7.5mL1某tripbuffer，洗涤至液面稍高于床顶，用塞子封住下口，直立放置4℃过夜③次日依次加入：5mL6M盐酸胍0.2N乙酸（57.3g盐酸胍+1.2mL冰乙酸+SW→100mL）5mLSW2.5mL2%SDS2.5mL25%无水乙醇2.5mL50%无水乙醇2.5mL75%无水乙醇12.5mL100%无水乙醇2.5mL75%无水乙醇2.5mL50%无水乙醇2.5mL25%无水乙醇2.5mLSW12.5mL100mMEDTApH8.0(1.861gEDTA+50mLSW调pH8.0)7.5mLSW7.5mL20%无水乙醇（加满细柱部分）4℃保存柱子变澄清（中途可离心收集沉淀，再次重悬，裂解，以释放更多的杂蛋白）。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
大肠杆菌表达的包涵体的纯化与复性研究
【实验技术】大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体的纯化与复性研究张少恩 孙晗笑 张光 杨清玲 沙文琼 刘俊云 龚莉桂【摘要】 目的 纯化、复性大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体蛋白。
方法 用8m olΠL尿素缓冲液变性溶解vMIP2Ⅱ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(S DS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除S DS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。
结果 重组vMIP2Ⅱ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。
结论 已获得了重组vMIP2Ⅱ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。
【关键词】 vMIP2Ⅱ包涵体;十二烷基磺酸钠;环氧糊精Purification and R enaturation of vMIP2ⅡI nclusion Body Expressed in E.coliZH ANG Shao2en,S UN Han2xiao,ZH ANG G uang,et al(Institute for G enomic Medicine,Jinan Univer sity,Guangzhou 510632,China)【Abstract】 Objective T o purify and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body protein expressed in E.coli.Methods The vMIP2Ⅱinclusion body expressed in E.coli was diss olved with8m olΠL urea,then further diss olved with S DS and purified by metal affinity chroma2 tography and m olecular sieve chromatography.Revm ove the S DS bound to protein m olecules by affinity column chromatography and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body by dialysis.Examine the structure of renaturalized protein by fluorometric assay and determine its activity by che2 m otaxis2inhibiting test of m ononuclear lymphocytes.R esults The recombinant vMIP2Ⅱwith intact higher2order structure was purified,re2natu2 ralized,and showed activity in inhibiting the chem otaxis of m ononuclear lymphocyte.Conclusion The recombinant vMIP2Ⅱprotein with activ2 ity was obtained.It laid a foundation of further application of the protein.【K ey w ords】 vMIP2Ⅱinclusion body;S DS;Cyclodextrins 病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(Virus macrophage in2 flammation protein2Ⅱ,vMIP2Ⅱ)是由人疱疹病毒8编码的蛋白,全基因编码95个氨基酸,成熟蛋白为74个氨基酸,与人的MIP同源性高达41%,其中8种非极性氨基酸占40%,具有较强的疏水性[1]。
包涵体制备,变复性,纯化
制备包涵体1、超声破碎细胞2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体.3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100液洗涤2 次4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体,包涵体蛋白的变性复性方法一1、在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\LEDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液2、剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解3、4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀4、加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h5、以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.方法二1、在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解.2、4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀3、所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.检测1、取出30 uL 备用2、向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃沸水处理5～10 min, 离心后取5 uL 上清上样, SDS-PAGE 检测相关试剂Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。
包涵体的纯化和复性总结
板块一、大肠杆菌(这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制.常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解,同样要做,为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧.我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右.二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心.我们判断的依据只是SDS—PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等.我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的!不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠.不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验,20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
包涵体变性亲和层析复性方法
包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0变性液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH 8.5洗脱液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，500mM 咪唑，pH 8.5复性液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG, 5% 甘油，1% PEG实验方法：1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解液，高压破碎，12000rpm离心30min，沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。
2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。
3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度至0.5 mg/ml左右。
再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6 h，然后透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h; 最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘油, pH 8.0)中。
5000 rpm 离心10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。
包涵体的纯化和复性总结全
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体变性、复性及纯化
包涵体变性、复性及纯化一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。
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一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0),2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100,1mg/ml溶菌酶。
(溶菌酶在这个pH围比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的."取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE.这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体?"而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。
总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。
然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。
菌体来自200ml培养液，用20ml PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1mg/ml，半小时后仍无明显变化。
因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0TE buffer，1mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。
因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。
到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。
据此可以判断细胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。
因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。
这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。
我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。
菌体来自500ml培养物，用30ml PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。
200ml菌液用18ml NaCl重悬，加入2ml25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20ul2M Tris碱，体系pH升到～8。
4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。
测pH 仍在8左右。
再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。
条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。
菌液有变化，但很不明显。
继续超声400次，从外观来看没有太大区别。
我简直要说tmd了。
见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要否很重要？我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200ml培养物用10ml重悬，我用20ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200ml用30－40ml重悬。
但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。
超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。
3、酵母的破碎酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。
我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：1机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）3尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0）高压匀浆。
（这个好象也该在方法2中）4液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶：1。
蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。
lyticase，可以从sigma定购。
这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。
此法的裂解效果不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0），据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。
一般应该用这个方法。
4、超声破碎的条件选择超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。
至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。
5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的DNaseI不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。
华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。
TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。
我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。
7、超声裂解细菌是否完全？最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察切记：只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。