植物细胞培养的基本技术_PPT幻灯片
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（1）、从病源菌方面来分析主要有： 细菌 真菌
（2）、从污染的途径而言主要是： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底、
植物组织培养时 表面处理的常用灭菌剂
选择灭菌剂的原则： （1）、 灭菌后易除去或易分解； （2）、 敏感的外植体的灭菌时间不宜过长 不敏感的外植体的灭菌时间应适当延长
常用灭菌剂的效果比较
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难， 且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物 细胞。
氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想， 适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为 2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌 时，可延长到20min或更长时间。
植物材料灭菌后，即可进行培养
二、培养基及其组成
培养基是“无菌土壤”，营养成 分可以根据代谢特点进行调控。
B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很
培养基成分
（1）、需要 大量无机盐 （2）、需要 碳源 （3）、需要 植物生长调节剂 （4）、需要 有机氮源 （5）、需要 维生素
（1）需要大量无机盐
根据无机离子在细胞内的作用分为四大类： 1、大分子的结构成分：主要是C、H、O、 N、P、S等； 2、各种酶反应所需的主要离子，包括 Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、Cl－等； 3、各种酶活性所需的基础微量元素，包括： Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+等； 4、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、 铯、溴等。
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
（3）、需要植物生长调节剂
植物生长调节剂：
是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括 人工合成的具有天然植物激素相似作用的化 合物和从生物中提取的天然植物激素。
到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种 植物激素：
生长素（最早被发现的植物激素） 分裂素 赤霉素 脱落酸 乙烯
生长素： 用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。 组织培养中常用的生长素有： 吲哚乙酸（IAA）：第一个被发现的内源激素， 是最先被人工合成的生长调节剂 二氯苯氧乙酸（2,4-D） 萘乙酸（NAA） 吲哚-3-丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） 对氯甲苯乙酸（P-CPA）
国家种质库是全国作物种质资源长期保存与 研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国 际植物遗传资源委员会的部分资助下，于 1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于 作物品种资源研究所。）
国家种质库外景
国家种质库长期库内景
一、植物材料的准备
2、外植体的消毒
污染的原因
污染：是指在组织培养过程中培养基 和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的 现象。
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
（5）、需要维生素
培养基必须加入B族维生素（B1、B6和泛酸）
还需加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷 酸肌醇【细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%~8%】 极性端的组分）
三、培养方法选择
1、培养方法
植物细胞/组织培养方法分类：
NAA、IAA、IBA易引起生根Βιβλιοθήκη Baidu2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长
细胞分裂素： 主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分 化不定芽。
常用的有： 6-苄（biàn）基嘌呤（BAP） 6-苄基腺嘌呤（6-BA） 激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT） 玉米素（zeatin、zt） 异戊稀氨基嘌呤（2-ip）
植物细胞培养技术的基本技术：
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
无机盐有大量元素和微量元素之分
大量元素： 使用浓度大于30mg/L的无机元素 包括N、P、S、K、Mg、Ca、Cl和Na
微量元素： 使用浓度低于30mg/L的无机元素、 如Fe、B、Mn、I、Mo（钼），以及极微 量的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、 Co或Al
（2）需要碳源
常使用的碳源： 糖类、肌醇 有时也用甘油等物质代替
固体培养基
液体培养
定义： 把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其 发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培 养的一种方法。
液体培养系统包括：
小规模的悬浮培养； 大规模的成批培养； 半连续培养； 连续培养。
悬浮培养
悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或 摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞 团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的 一种培养方式。
材料太大:易污染，也不需要； 材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。
一般选取培养材料的大小，在0.5cm—— 1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则 应更小。
用于植物组织培养的外植体
最重要的是无菌
植物组织培养的外植体必须是无杂菌材 料。培养前要进行严格的灭菌处理。
无杂菌材料来源：
种质库（种质库是用来保存种质资源（一般 为种子）的低温保存设施。
（2）、从污染的途径而言主要是： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底、
植物组织培养时 表面处理的常用灭菌剂
选择灭菌剂的原则： （1）、 灭菌后易除去或易分解； （2）、 敏感的外植体的灭菌时间不宜过长 不敏感的外植体的灭菌时间应适当延长
常用灭菌剂的效果比较
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难， 且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物 细胞。
氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想， 适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为 2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌 时，可延长到20min或更长时间。
植物材料灭菌后，即可进行培养
二、培养基及其组成
培养基是“无菌土壤”，营养成 分可以根据代谢特点进行调控。
B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很
培养基成分
（1）、需要 大量无机盐 （2）、需要 碳源 （3）、需要 植物生长调节剂 （4）、需要 有机氮源 （5）、需要 维生素
（1）需要大量无机盐
根据无机离子在细胞内的作用分为四大类： 1、大分子的结构成分：主要是C、H、O、 N、P、S等； 2、各种酶反应所需的主要离子，包括 Ca2+、Cu2+、Mg2+、K+、Na+、Cl－等； 3、各种酶活性所需的基础微量元素，包括： Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Zn2+等； 4、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、 铯、溴等。
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
（3）、需要植物生长调节剂
植物生长调节剂：
是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括 人工合成的具有天然植物激素相似作用的化 合物和从生物中提取的天然植物激素。
到目前为止，已发现植物组织中可以形成5种 植物激素：
生长素（最早被发现的植物激素） 分裂素 赤霉素 脱落酸 乙烯
生长素： 用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。 组织培养中常用的生长素有： 吲哚乙酸（IAA）：第一个被发现的内源激素， 是最先被人工合成的生长调节剂 二氯苯氧乙酸（2,4-D） 萘乙酸（NAA） 吲哚-3-丁酸（IBA） 萘氧乙酸（NOA） 对氯甲苯乙酸（P-CPA）
国家种质库是全国作物种质资源长期保存与 研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国 际植物遗传资源委员会的部分资助下，于 1986年10月在中国农业科学院落成，隶属于 作物品种资源研究所。）
国家种质库外景
国家种质库长期库内景
一、植物材料的准备
2、外植体的消毒
污染的原因
污染：是指在组织培养过程中培养基 和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的 现象。
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
（5）、需要维生素
培养基必须加入B族维生素（B1、B6和泛酸）
还需加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷 酸肌醇【细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%~8%】 极性端的组分）
三、培养方法选择
1、培养方法
植物细胞/组织培养方法分类：
NAA、IAA、IBA易引起生根Βιβλιοθήκη Baidu2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长
细胞分裂素： 主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分 化不定芽。
常用的有： 6-苄（biàn）基嘌呤（BAP） 6-苄基腺嘌呤（6-BA） 激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT） 玉米素（zeatin、zt） 异戊稀氨基嘌呤（2-ip）
植物细胞培养技术的基本技术：
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
无机盐有大量元素和微量元素之分
大量元素： 使用浓度大于30mg/L的无机元素 包括N、P、S、K、Mg、Ca、Cl和Na
微量元素： 使用浓度低于30mg/L的无机元素、 如Fe、B、Mn、I、Mo（钼），以及极微 量的Cu和Zn。某些情况下，还可加入Ni、 Co或Al
（2）需要碳源
常使用的碳源： 糖类、肌醇 有时也用甘油等物质代替
固体培养基
液体培养
定义： 把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其 发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培 养的一种方法。
液体培养系统包括：
小规模的悬浮培养； 大规模的成批培养； 半连续培养； 连续培养。
悬浮培养
悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或 摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞 团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的 一种培养方式。
材料太大:易污染，也不需要； 材料太小:多形成愈伤组织，甚至难于成活。
一般选取培养材料的大小，在0.5cm—— 1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则 应更小。
用于植物组织培养的外植体
最重要的是无菌
植物组织培养的外植体必须是无杂菌材 料。培养前要进行严格的灭菌处理。
无杂菌材料来源：
种质库（种质库是用来保存种质资源（一般 为种子）的低温保存设施。