蒿甲醚治疗急性弓形虫感染的可行性研究

蒿甲醚治疗急性弓形虫感染的可行性研究

陈冲，邸宝华，李昕

天津医科大学医学检验学系，天津 (300203)

E-mail：chenchong_1998120@

摘要：目的研究中药—蒿甲醚在治疗弓形虫感染中作用，以为临床弓形虫感染提供新的治疗策略。方法建立弓形虫感染的小鼠模型。将感染弓形虫的小鼠分为两组，分别给予蒿甲醚及复方新诺明治疗。观察各组小鼠的存活情况，并且采用PCR的方法取小鼠肝脏进行检测。结果蒿甲醚组的存活率73.3%、复方新诺明组的存活率为60%，两种药物治疗效果的比较具有统计学意义（P＜0.05），蒿甲醚组治疗效果优于复方新诺明组。结论本研究从作用机制理论上说明蒿甲醚具有治疗弓形虫的作用。通过实验结果表明蒿甲醚对治疗急性弓形虫感染有一定的疗效，为蒿甲醚用于临床治疗弓形虫病提供依据。

关键词：蒿甲醚，弓形虫病，作用机制，PCR，药物治疗

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫，属真球虫目，弓形虫科。1908年法国学者Nicolle及 Manceaux在北突尼斯的一种啮齿动物刚地梳趾鼠的肝脾单核细胞中发现，因其滋养体呈弓形，故命名为弓形虫[1]。该虫遍布于世界各地，人群感染相当广泛，许多国家的感染率在 25％～50％，欧洲一些发达国家高达80％，我国在5％～10％左右[2]，而孕妇的弓形虫感染率达10％，且新近感染和活动性感染可占45％[3 4]，潜伏孕妇弓形虫感染率有逐年上升趋势，我国每年大约有九万例先天性弓形虫患儿出生,弓形虫病已成为影响胎儿、新生儿正常生长发育的重要原因。

许多资料还表明孕妇弓形虫感染率较高，并与异常产密切相关，弓虫感染是导致胎儿畸形、缺陷的危险生物因子之一。孕妇在早孕期．促性腺激素、孕酮和乙烯雌酚增加，从而增加了对自然杀伤细胞的抑制作用，激发潜在的感染，感染的弓形虫包囊破裂引起复发[5]，孕妇感染后易于垂直传染给胎儿，引起畸形或缺陷、流产或死胎。有的虽能维持到足月分娩，但出生后多为无临床症状的先天性弓形虫病(实验诊断为阳性)，有可能于数年后发生远期并发症，刘爱芹[6]等对不明原因智力低下学生的弓形虫感染情况进行了调查，提示不明原因的智力低学生中弓形虫感染较高，弓形虫感染治疗应引起重视。

弓形虫病的传统治疗方法是以乙胺嘧啶与磺胺嘧啶（或复方新诺明）合用为主，虽取得一定疗效，但其用量大、疗程长、毒副反应发生率高[7]，而对于弓形虫脑炎及免疫缺陷病人不能耐受长期治疗，停药后复发率高，故根治效果差。本研究中用蒿甲醚治疗急性弓形虫感染小鼠，观察蒿甲醚早期治疗小鼠弓形虫病的效果，试图寻找一种高效、低毒的抗弓形虫感染的中药药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1 虫株：采用国际标准强毒株RH株弓形虫速殖子，虫源自本校基础医学院寄生虫学教研室，小鼠腹腔传代方式保存。

2 小鼠：采用远交系雌性昆明小鼠，体重20-25 g, 由中国医科院动物繁育所提供。

3 药物：蒿甲醚片剂，由昆明制药厂生产批号 06075101 ；复方新诺明片（SMZco）片剂，由天津太平洋有限公司生产，含SMZ400mg/片，TMP80mg/片，批号 060810

4 引物：参照文献[8]设计引物（ burg,1989）,该引物来自弓形虫B1基因，由美国CyberSyn 公司合成（经RPC纯化），扩增片段长度194bp.

引物1：5 GGAACTGCATCCGTTCATGAG 3（694—714bp）

引物2：5 TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC 3 (887----868bp)

5 PCR扩增系统：聚合酶及扩增缓冲液购自润泰公司扩增仪为美国公司生产的MJPCR 仪型号 PTC---200 。

6 分子量标准及其它试剂：PBR322/HaeⅢ酶切、琼脂糖自华美公司；蛋白酶K由Merck 公司生产。

1.2 方法

1 动物模型的建立：取RH株弓形虫速殖子常规腹腔感染72h的小鼠腹水，无菌条件下以生理盐水稀释至5×103，每只小鼠腹腔内注射0.4ml，相当于2×103个速殖子。

2 实验分组及给药分法：将实验小鼠随机分为4组，每组15只（1）未治疗组（感染后未抗虫治疗，给予生理盐水作对照）；（2）空白对照组（未感染弓形虫给予蒿甲醚）（3）阳性对照组（SMZco400mg/Kg.d）；（4）药物治疗组（蒿甲醚300mg/ Kg.d）。于感染后8h灌胃，每24h灌胃1次，定时给药，疗程14天,观察到感染后30天。

3 PCR检测：

(1) 取材：分别在阳性对照组全部死亡时（感染后第8天），疗程结束时（感染后第15天），观察结束时（感染后第30天），从治疗组小鼠中选取1只脱颈处死，取其肝脏进行弓形虫的PCR检测。

(2) DNA提取：取1g肝脏组织加入少量STE缓冲液，在乳钵中制成匀浆，加上述裂解注脚，使蛋白酶浓度达，水浴消化，过夜；按常规酚；氯仿；异戊醇法提取DNA，并用少量溶解，分装后-20℃备用。

(3) 扩增系统；扩增缓冲液。用灭菌双蒸水补足反应终体积，以灭菌液体石蜡封顶，瞬时离心混匀，并设阴性对照。

（4）反应条件；预变性94℃，3min，三温循环94℃，60℃ 3s，72℃ 30s,40个循环，末延伸72℃ 5min。

（5）产物分析；采用琼脂糖凝胶电泳，制备2%含0。5ug/mL溴乙锭的凝胶，水平槽电泳，取10ul扩增产物及26加样缓冲液点样，缓冲液中电泳，80V，55mA约40min后紫外光（λ=254nm）下观察结果。

4 统计分析；采有χ2检验进行各组存活率显著性检验。

2 实验结果

2.1 实验模型建立的结果

表1 各组小鼠弓形虫感染阳性率

小鼠数（只）感染数（只）感染率%

未治疗组15 15 100%

阳性对照组15 15 100%

药物治疗组15 15 100%

空白对照组15 0 0