CRISPR Cas9敲除细胞系构建步骤及方法

CRISPR/Cas9敲除细胞系构建步骤及方法

一、技术简介

CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，也是目前研究最热的基因编辑技术。由于其具有构建方法简单快捷、基因修饰效率高、成本低廉、实验周期短、适用范围广等诸多优点，目前已成功应用于人类细胞、斑马鱼、大/小鼠等多种动植物的基因组精确修饰。

二、实验流程

1. 预实验

1.1 Cas9导入细胞方法：尝试各种方法，如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等，确定高效导入Cas9方法。

1.2 药物浓度预实验：降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。

1.3 单克隆培养情况：确认细胞是否可以单克隆培养。

2. 基因敲除（敲入）

2.1 靶点设计：一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个，效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。

2.2 载体构建和病毒包装：根据预实验结果，选择合适的普通载体或病毒载体（普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体）。

2.3 内源活性筛选：转染细胞或感染细胞48h后，使用Puro或Blasticidin筛选48h，提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性，将有效的突变型PCR产物测序验证。

2.4 Donor载体（基因敲入）：根据筛选的gRNA靶点位置，构建Donor普通载体或腺病毒载体，共转染/感染Cas9-gRNA和Donor。

2.5 单克隆筛选：无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少2个96孔板。细胞数量足够后，验证内源活性并送测。

2.6 获得突变型：如需纯合子，则可能需要重复步骤3-5。