3H-TdR掺入法检测淋巴细胞转化率

3H-TdR掺入法检测淋巴细胞转化率

—液体闪烁滤膜测量法

【目的】

1.掌握示踪法的原理及其在机体免疫功能检测上的应用。

2.初步掌握液认计数滤膜测量的基本技术。

【原理】

胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA合成的前身物。人外周血T淋巴细胞在PHA 刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄取TdR用以合成DNA。与此同时，3H-TdR也不断地被摄入细胞内而被放射性标记。通过液体闪烁计数测量方法，便可了解淋巴细胞增殖活动的情况，籍以了解机体的细胞免疫功能。

【材料和方法】

1、主要材料：

消毒肝素抗凝管（内含肝素10～20单位）、注射器、微量加样器、微量细胞培养板、49型玻璃纤维滤膜、离心机、细胞培养箱、干燥箱、多头细胞收集器，FJ-2107液体闪烁计数仪。

2、主要试剂

完全RPMI-1640培养液（内含15% FCS，25 mM Hepes，5×10-2 mM=巯基乙醇），植物血凝素（PHA，用完全RPMI—1640配成浓度为30 ug/ml）；3H-TdR 工作液18.5KBq/20 ul（中国原子能研究院同位素所）。闪烁液（二甲苯1000 ml,ppo 7 g,popop 0.5 g）。

3、主要步骤

①静脉采血肝素抗凝，充分摇匀后加入细胞微量培养板内（20 ul/孔）。每个样品设自发转化孔和分裂原刺激孔，均为三个复孔。

②自发转化孔每孔内加完全RPMI 1640液0.2 ml，分裂原刺激孔每孔内加PHA液0.1 ml, RPMI 1640液0.1 ml。加样后，轻轻震荡混匀，置37℃CO2培养箱内培养。

③细胞培养至56 h，每孔内加入3H-TdR工作液各20 ul。轻轻震荡混匀后置

37℃,CO 2培养箱内继续培养至72 h 终止培养。

④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤膜上，将滤膜置烤箱内烘干。

⑤滤膜冷却后移入存有5 ml 闪烁液的闪烁杯中，避光放置一段时间后，用FJ-2107液闪计数器测量放射性，结果用刺激指数（SI ）表示。

刺激指数（SI ）=cpm

cpm cpm cpm 本底自发转化孔本底刺激孔--

实验概要

熟悉混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte cultue ，MLC)的原理；掌握分离淋巴细胞的方法；学习用同位素标记进行混合淋巴细胞培养的操作方法。

实验原理

混合淋巴细胞培养或称混合淋巴细胞反应（MLR ）是将二个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内DNA 和胞浆内RNA 合成增加等。可通过形态学方法计数转化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA 合成的前体-3H 标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR ）掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。其增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。

本法有双向和单向MLC 之分，在双向MLC 中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞；在单向MLC 中，将一方的淋巴细胞用X 线照射或用丝裂霉素C 处理，使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLC 只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。 主要试剂

1. RPMI 1640培养液（100mL ）：内含经56℃、30min 灭活的小牛血清10mL 、双抗（青、链霉素）lmL ，用5.6%NaHCO3调pH 至 7.2～7.4；

2. 丝裂霉索C （mitomycin C ）：用双蒸水配成400μg/mL 溶液；

3. 3H-TdR ：用生理盐水稀释为500μg/mL ，4℃存放；

4. 闪烁液、生理盐水。

主要设备

1. 离心管

2. 滴管

3. 微量加样器

4. 试管架

5. 同位素微量加样器

6. 同位素测量杯

7. 49型玻璃纤维滤片

8. 超净工作台

9. 细胞培养板

10. CO2培养箱

11. 离心机

12. 细胞收集仪

13. β液闪烁计数仪等

实验材料

人外周血淋巴细胞：取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。洗涤后用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106/mL。

实验步骤

1. 将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A的作为MLC的反应细胞，个体B 的作为MLC的刺激细胞，记作Bm；

2. 刺激细胞处理：取个体B的淋巴细胞悬液0.9mL，加人400μg/mL的丝裂霉素C 0.1mL，使其终浓度为40μg/mL细胞悬液，置37℃水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至1×106/mL；

3. 用微量加样器各取0.1mL反应细胞（A）和刺激细胞（Bm）于一圆底细胞培养板的孔中（A Bm），同时，设自身对照组AA或BBm和空白对照组。置37℃5%CO2培养箱内培养5d。

4. 在培养终止前15～16h，用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdR 1μL（含0.5μCi）。空白对照组，此时不加同位素；

5. 样品处理：用细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用生理盐水洗去游离的3H-TdR、将滤片置60℃烘箱中烤干，冷却后将滤片放入含闪烁液的测量杯中，用β体闪烁测量仪检测放射强度。空白对照在样品处理前加入同位素，处理方法同实验组；

6. 实验结果计算：以每分钟脉冲数（counts per minute，cpm）表示。所有样品在数据处理前，均应减去空白对照组的cpm值。MLC反应强度通常以样品的cpm值或刺激指数（stimulation index，SI）表示；也可用cpm净值表示。